V\u010del\u00ed jed a melitt\u00edn zni\u017euj\u00fa \u017eivotaschopnos\u0165 rakoviny prsn\u00edka
Na pos\u00fadenie protirakovinovej \u00fa\u010dinnosti a selektivity sa jed z oboch eur\u00f3pskych v\u010diel zozbieran\u00fdch v Perthe v Austr\u00e1lii a melit\u00ednov\u00fd peptid hodnotili v testoch d\u00e1vka-odpove\u010f v paneli bunkov\u00fdch l\u00edni\u00ed reprezentat\u00edvnych pre vn\u00fatorn\u00e9 podtypy rakoviny prsn\u00edka av netransformovan\u00fdch bunk\u00e1ch (obr. 1a). V\u010del\u00ed jed vykazoval vysok\u00fa protirakovinov\u00fa selektivitu s v\u00fdrazne vy\u0161\u0161ou \u00fa\u010dinnos\u0165ou v TNBC (napr. SUM159 a SUM149) a v bunkov\u00fdch l\u00edni\u00e1ch rakoviny prsn\u00edka obohaten\u00fdch HER2 (napr. MDA-MB-453 a SKBR3), po ktor\u00fdch nasledovali lumin\u00e1lne bunky rakoviny prsn\u00edka ( vr\u00e1tane MCF7 a T-47D), s najni\u017e\u0161\u00edm vplyvom na norm\u00e1lne bunky (prim\u00e1rne derm\u00e1lne fibroblastov\u00e9 bunky HDFa a prsn\u00e9 netransformovan\u00e9 bunky MCF 10A a MCF-12A) (obr. 1b, v\u013eavo; tabu\u013eka 1; GLM, Wald Chi-Square\u2009= 342, p\u2009<\u20090,001, n\u2009=\u200933, df\u2009=\u20091). V porovnan\u00ed s norm\u00e1lnou bunkovou l\u00edniou HDFa (22,17\u2009ng\/) sa pozorovalo v\u00fdznamn\u00e9 zn\u00ed\u017eenie polovi\u010dnej maxim\u00e1lnej inhibi\u010dnej koncentr\u00e1cie (IC50) pre rakovinov\u00e9 bunkov\u00e9 l\u00ednie TNBC SUM159 (5,58\u2009ng\/\u03bcL) aj HER2 obohaten\u00e9 SKBR3 (5,77\u2009ng\/\u03bcL). 1c, v\u013eavo, jednosmern\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,01).<\/p>\n\n\n\n
![\"\"](\"http:\/\/apitoxin.sk\/wp-content\/uploads\/2022\/07\/1-657x1024.jpg\")
Tabu\u013eka 1 Polovi\u010dn\u00e9 maxim\u00e1lne inhibi\u010dn\u00e9 koncentr\u00e1cie (IC50) v\u010delieho jedu a melit\u00ednu.<\/p>\n\n\n\n Podobne bol melit\u00edn v\u00fdznamne \u00fa\u010dinnej\u0161\u00ed proti HER2-obohatenej rakovine prsn\u00edka a TNBC v porovnan\u00ed s norm\u00e1lnymi bunkami (obr. 1b, c, vpravo; tabu\u013eka 1; GLM, Wald Chi-Square\u2009=\u200912,9, p\u2009<\u20090,001, n\u2009=\u200933, df\u2009= 1), s hodnotami IC50 od 0,94 do 1,49\u2009\u03bcM v \u013eudsk\u00fdch bunk\u00e1ch rakoviny prsn\u00edka obohaten\u00fdch o TNBC a HER2 a 1,03 a\u017e 2,62\u2009\u03bcM v netransformovan\u00fdch bunk\u00e1ch. Testy bunkovej \u017eivotaschopnosti v\u010delieho jedu a melit\u00ednu v my\u0161acej rakovine prsn\u00edka a norm\u00e1lnych bunkov\u00fdch l\u00edni\u00e1ch potvrdili zv\u00fd\u0161en\u00fa selektivitu pre agres\u00edvne my\u0161acie n\u00e1dorov\u00e9 bunkov\u00e9 l\u00ednie, ako je p53-mutant claud\u00edn-low T11 a BRCA-mutant B.1537,38 (doplnkov\u00fd obr\u00e1zok 1).<\/p>\n\n\n\n Jed v\u010diel z r\u00f4znych popul\u00e1ci\u00ed v\u010diel v \u00cdrsku a Anglicku zn\u00ed\u017eil \u017eivotaschopnos\u0165 buniek SUM159 a SKBR3 podstatne viac ako netransformovan\u00fdch buniek HDFa (obr. 1d, jednosmern\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,001). Testovali sme aj jed \u010dmeliaka Bombus terrestris z Anglicka. Vzorky od robotn\u00edc aj kr\u00e1\u013eovien vyvolali minim\u00e1lnu bunkov\u00fa smr\u0165 v bunk\u00e1ch rakoviny prsn\u00edka v porovnan\u00ed s jedom v\u010diel aj pri vysok\u00fdch koncentr\u00e1ci\u00e1ch jedu (obr. 1e).<\/p>\n\n\n\n Vyvinuli sme my\u0161aciu monoklon\u00e1lnu protil\u00e1tku rozpozn\u00e1vaj\u00facu melit\u00edn na pos\u00fadenie relat\u00edvneho mno\u017estva melit\u00ednu vo v\u0161etk\u00fdch vzork\u00e1ch jedu v\u010diel a \u010dmeliakov pomocou ELISA. V s\u00falade s vy\u0161\u0161ie uveden\u00fdmi \u0161t\u00fadiami aktivity sa relat\u00edvna abundancia melit\u00ednu v\u00fdznamne nel\u00ed\u0161ila vo v\u0161etk\u00fdch vzork\u00e1ch v\u010delieho jedu z r\u00f4znych miest (obojsmern\u00e1 ANOVA, p\u2009>\u20090,999). Av\u0161ak koncentr\u00e1cie melitt\u00ednu boli v\u00fdznamne vy\u0161\u0161ie vo vzork\u00e1ch v\u010diel v porovnan\u00ed s jedom \u010dmeliaka a izotypovou IgG kontrolou (obr. 1f, dvojcestn\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,001).<\/p>\n\n\n\n Protirakovinov\u00e9 \u00fa\u010dinky melit\u00ednu boli potvrden\u00e9 blokovac\u00edmi experimentmi in vitro, v ktor\u00fdch sme vyu\u017eili anti-melit\u00ednov\u00fa protil\u00e1tku na z\u00e1chranu \u017eivotaschopnosti buniek v bunk\u00e1ch HDFa a SUM159. Bunky boli o\u0161etren\u00e9 v\u010del\u00edm jedom alebo melit\u00ednom v kombin\u00e1cii so zvy\u0161uj\u00facimi sa koncentr\u00e1ciami protil\u00e1tky proti melit\u00ednu. \u017divotaschopnos\u0165 buniek bola signifikantne vy\u0161\u0161ia, ke\u010f bol melit\u00edn blokovan\u00fd protil\u00e1tkou proti melit\u00ednu pre bunky HDFa a SUM159 vystaven\u00e9 v\u010del\u00edmu jedu alebo peptidu melit\u00ednu (obr. 1g, t testy, p\u2009<\u20090,0001). Tieto \u00fadaje nazna\u010duj\u00fa, \u017ee melit\u00edn pr\u00edtomn\u00fd v jede v\u010diel je najv\u00fdznamnej\u0161ou bioakt\u00edvnou protirakovinovou zl\u00fa\u010deninou spomedzi v\u0161etk\u00fdch \u0161tudovan\u00fdch jedov. Na v\u0161etky \u010fal\u0161ie experimenty sa pou\u017eil v\u010del\u00ed jed zozbieran\u00fd v austr\u00e1lskom Perthe.<\/p>\n\n\n\n V\u010del\u00ed jed a melitt\u00edn sp\u00f4sobuj\u00fa smr\u0165 buniek rakoviny prsn\u00edka Obr. 2: V\u010del\u00ed jed a melitt\u00edn indukuj\u00fa apopt\u00f3zu a naru\u0161enie membr\u00e1ny.<\/p>\n\n\n\n Na kvantifik\u00e1ciu apoptotick\u00fdch, nekrotick\u00fdch alebo m\u0155tvych bunkov\u00fdch popul\u00e1ci\u00ed po lie\u010dbe sme vykonali test detekcie apopt\u00f3zy Annexin V-FITC. Bunky SUM159 boli vystaven\u00e9 p\u00f4sobeniu vehikula, v\u010delieho jedu alebo melit\u00ednu s pou\u017eit\u00edm koncentr\u00e1ci\u00ed IC50 a spracovan\u00e9 prietokovou cytometriou po 60-min\u00fatovom o\u0161etren\u00ed (obr. 2b). Zistili sme signifikantne viac neskor\u00fdch apoptotick\u00fdch\/nekrotick\u00fdch buniek pre vzorky o\u0161etren\u00e9 melit\u00ednom (23,6\u2009\u00b1\u20095,7 %) v porovnan\u00ed s v\u010del\u00edm jedom (8,3\u2009\u00b1\u20091,9 %) a kontrolou s vehikulom (4,8\u2009\u00b1\u20090,4 %, obojsmern\u00e1 ANOVA, p\u200901\u2009, priemer 0. \u00b1\u2009SEM). Neexistovali v\u0161ak \u017eiadne v\u00fdznamn\u00e9 rozdiely v hladin\u00e1ch skor\u00fdch apoptotick\u00fdch alebo nekrotick\u00fdch buniek vo v\u0161etk\u00fdch podmienkach (dvojcestn\u00e1 ANOVA, p\u2009>\u20090,05, priemer\u2009\u00b1\u2009SEM). Aby sa charakterizovala kinetika bunkovej smrti v krat\u0161\u00edch \u010dasoch, merala sa \u017eivotaschopnos\u0165 buniek pre bunky HDFa, SKBR3 a SUM159 o\u0161etren\u00e9 a\u017e 1 hodinu s koncentr\u00e1ciami IC50 v\u010delieho jedu alebo melit\u00ednu (obr. 2c). V\u010del\u00ed jed rap\u00eddne zn\u00ed\u017eil \u017eivotaschopnos\u0165 buniek bez v\u00fdznamn\u00e9ho rozdielu medzi norm\u00e1lnymi a rakovinov\u00fdmi bunkov\u00fdmi l\u00edniami v priebehu hodiny (obojsmern\u00e1 ANOVA, p\u2009=\u20090,97). Na rozdiel od toho melit\u00edn v\u00fdznamne zn\u00ed\u017eil \u017eivotaschopnos\u0165 oboch bunkov\u00fdch l\u00edni\u00ed rakoviny prsn\u00edka v porovnan\u00ed s norm\u00e1lnymi bunkami od 10\u2009 min \u010falej a SUM159 v\u00fdznamne viac ako SKBR3 od 30\u2009 min \u010falej (dvojcestn\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,0001).<\/p>\n\n\n\n Konfok\u00e1lna mikroskopia \u017eiv\u00fdch buniek (obr. 2d) a skenovacia elektr\u00f3nov\u00e1 mikroskopia (obr. 2e) v bunk\u00e1ch SKBR3 a SUM159 uk\u00e1zali r\u00fdchle naru\u0161enie a zmr\u0161\u0165ovanie plazmatickej membr\u00e1ny pomocou v\u010delieho jedu a melit\u00ednu v porovnan\u00ed s lie\u010dbou vehikulom po\u010das 10 a\u017e 60 min\u00fat.<\/p>\n\n\n\n RGD zvy\u0161uje zacielenie melitt\u00ednu na rakovinu prsn\u00edka Obr. 3: Technika melit\u00ednu s mot\u00edvom RGD zvy\u0161uje selektivitu rakoviny prsn\u00edka.<\/p>\n\n\n\n Na zv\u00fd\u0161enie selektivity rakovinov\u00fdch buniek sme vytvorili bifunk\u010dn\u00fd melit\u00ednov\u00fd peptid skon\u0161truovan\u00edm N-koncov\u00e9ho alfa-helik\u00e1lneho peptidov\u00e9ho mot\u00edvu RGD (RGD1-melitt\u00edn, odvoden\u00fd z TGF-p3, sekvencia HGRGDLGRLKK), ktor\u00fd interaguje s integr\u00ednmi avp6 a avp3 nadmerne exprimovan\u00fdmi pri rakovine prsn\u00edka bunkov\u00e9 membr\u00e1ny a vaskulat\u00fara spojen\u00e1 s n\u00e1dorom44,45,46. Ke\u010f s\u00fa RGD mot\u00edvy upraven\u00e9 pomocou bioakt\u00edvnych peptidov, zvy\u0161uj\u00fa zacielenie na bunky rakoviny prsn\u00edka47. Hodnota IC50 RGD1-melit\u00ednu sa v\u00fdznamne nel\u00ed\u0161ila v porovnan\u00ed s rodi\u010dovsk\u00fdm melitt\u00ednom v bunk\u00e1ch T11, \u010do nazna\u010duje, \u017ee \u00fa\u010dinnos\u0165 nebola ovplyvnen\u00e1 mot\u00edvom RGD (obr. 3b, t test, p\u2009=\u20090,652). Ak vezmeme do \u00favahy pomery IC50 HDFa\/SUM159 pre RGD1-melit\u00edn (2,73\u2009\u00b1\u20090,14) v porovnan\u00ed s melit\u00ednom (1,76\u2009\u00b1\u20090,04), mot\u00edv RGD v\u00fdznamne zv\u00fd\u0161il terapeutick\u00e9 okno medzi norm\u00e1lnymi a TNBC bunkov\u00fdmi l\u00edniami, \u010do potvrdzuje zv\u00fd\u0161en\u00fa selektivitu rakovinov\u00fdch buniek pomocou RGD (obr. 3c, t test, p\u2009<\u20090,01, priemer\u2009\u00b1\u2009SEM). Indukcia apopt\u00f3zy v SUM159 TNBC bunk\u00e1ch o\u0161etren\u00fdch melit\u00ednom, DEDE-melit\u00ednom a RGD1-melit\u00ednom po\u010das 24 hod\u00edn potvrdila protirakovinov\u00fa aktivitu melit\u00ednu aj RGD1-melit\u00ednu, ale nie DEDE-melit\u00ednu (obr. 3d).<\/p>\n\n\n\n V s\u00falade s protirakovinovou aktivitou melit\u00ednu a RGD1-melit\u00ednu sme zistili, \u017ee interakcia medzi anti-melit\u00ednovou protil\u00e1tkou a melit\u00ednom sa v\u00fdznamne nel\u00ed\u0161ila od interakcie s RGD1-melit\u00ednom (obr. 3e, dvojcestn\u00e1 ANOVA, p\u2009>\u20090,999), ale bola v\u00fdznamne odli\u0161n\u00e1 od DEDE-melitt\u00ednu a SV40-melit\u00ednu (dvojcestn\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,05), pri\u010dom absorbancia SV40-melit\u00ednu sa v\u00fdznamne nel\u00ed\u0161ila od IgG kontroly (dvojcestn\u00e1 ANOVA, p\u2009>\u20090,1). Tieto \u00fadaje nazna\u010duj\u00fa, \u017ee na\u0161a monoklon\u00e1lna anti-melit\u00ednov\u00e1 protil\u00e1tka rozpozn\u00e1va konforma\u010dn\u00fd epitop, ktor\u00fd nie je naru\u0161en\u00fd skon\u0161truovan\u00edm N-koncov\u00e9ho zameriavacieho peptidu.<\/p>\n\n\n\n Modelovacie \u0161t\u00fadie uk\u00e1zali, \u017ee konform\u00e1cia melit\u00ednovej \u010dasti upraven\u00fdch peptidov nebola naru\u0161en\u00e1 ani C-termin\u00e1lnymi mut\u00e1ciami, ani N-termin\u00e1lnou ad\u00edciou RGD mot\u00edvu (obr. 3f). Ka\u017ed\u00fd peptid si zachoval charakteristick\u00fa ohnut\u00fa \u0161trukt\u00faru alfa-helixu, ktor\u00e1 potenci\u00e1lne u\u013eah\u010duje tvorbu p\u00f3rov4, \u010do nazna\u010duje, \u017ee rozdiely v protirakovinovej aktivite medzi mutantmi s\u00fa sp\u00f4soben\u00e9 elektrostatick\u00fdmi interakciami s membr\u00e1nou a nie ve\u013ek\u00fdmi zmenami v \u0161trukt\u00fare peptidu.<\/p>\n\n\n\n \u010ealej sme pou\u017eili anti-melit\u00ednov\u00fa protil\u00e1tku na detekciu subcelul\u00e1rnej lokaliz\u00e1cie akt\u00edvnych peptidov imunofluorescenciou v TNBC SUM159 bunk\u00e1ch o\u0161etren\u00fdch 30\u2009min vehikulom, v\u010del\u00edm jedom, melit\u00ednom, RGD1-melit\u00ednom alebo DEDE-melitt\u00ednom v koncentr\u00e1ci\u00e1ch IC50 (obr. 3g ). Nez\u00e1visle od toho, \u010di boli bunky vystaven\u00e9 v\u010del\u00edmu jedu, melit\u00ednu alebo RGD1-melit\u00ednu, melit\u00edn bol lokalizovan\u00fd preva\u017ene na plazmatickej membr\u00e1ne buniek nadmerne exprimuj\u00facich EGFR, so stup\u0148om intracelul\u00e1rneho zafarbenia v v\u010del\u00edm jedu a bunk\u00e1ch o\u0161etren\u00fdch melit\u00ednom, potenci\u00e1lne v d\u00f4sledku naru\u0161enia membr\u00e1ny a tvorba endoz\u00f3mov, ako sa uv\u00e1dza inde25,48. Okrem toho sa vzor farbenia RGD1-melit\u00ednu javil ako zrete\u013ene zameran\u00fd na plazmatick\u00fa membr\u00e1nu samotn\u00fa, \u010do by bolo v s\u00falade so zv\u00fd\u0161enou selektivitou cie\u013eov\u00e9ho peptidu pre \u010dasti povrchu n\u00e1dorov\u00fdch buniek. Pozorovali sme nedostatok reaktivity melit\u00ednovej protil\u00e1tky v bunk\u00e1ch o\u0161etren\u00fdch DEDE-melit\u00ednom. V s\u00fahrne tieto v\u00fdsledky ukazuj\u00fa, \u017ee zatia\u013e \u010do mot\u00edv RGD zvy\u0161uje zacielenie melit\u00ednu na bunkov\u00e9 membr\u00e1ny rakoviny prsn\u00edka, pozit\u00edvny mot\u00edv na C-konci sa zd\u00e1 by\u0165 nevyhnutn\u00fd pre protirakovinov\u00fa aktivitu. <\/p>\n\n\n\n V\u010del\u00ed jed a melit\u00edn potl\u00e1\u010daj\u00fa fosforyl\u00e1ciu RTK Obr. 4: V\u010del\u00ed jed a melit\u00edn potl\u00e1\u010daj\u00fa fosforyl\u00e1ciu EGFR a HER2.<\/p>\n\n\n\n Lie\u010dba v\u010del\u00edm jedom a melit\u00ednom v bunk\u00e1ch SKBR3 v\u00fdrazne zn\u00ed\u017eila p-HER2 (Tyr1248), p-EGFR (Tyr1068), p-p44\/42 MAPK (Thr202\/Tyr204), p-Akt (Ser473 a Thr308), p-SAPK\/JNK (Thr183\/Tyr185) a p-p38 MAPK (Thr180\/Tyr182) od 5\u2009 min \u010falej (obr. 4a, v\u013eavo; doplnkov\u00fd obr\u00e1zok 4), s miernym poklesom celkov\u00e9ho prote\u00ednu HER2, EGFR a Akt iba po 10 min. lie\u010dby v\u010del\u00edm jedom, \u010do by mohlo s\u00favisie\u0165 s degrad\u00e1ciou receptorov sprostredkovanou endoz\u00f3mami25. V SUM159 bol p-EGFR (Tyr1068) silne downregulovan\u00fd v\u010del\u00edm jedom a melit\u00ednom od 10 do 20 min\u00fat. Lie\u010dba SUM159 melit\u00ednom tie\u017e potla\u010dila p-Akt (Ser473 a Thr308) vo v\u0161etk\u00fdch \u010dasov\u00fdch bodoch, ale zv\u00fd\u0161ila regul\u00e1ciu p-p44\/42 MAPK (Thr202\/Tyr204), p-SAPK\/JNK (Thr183\/Tyr185) a p-p38 MAPK ( Thr180\/Tyr182) od 10 do 20\u2009min, zatia\u013e \u010do jed v\u010diel zv\u00fd\u0161il regul\u00e1ciu p-p44\/42 MAPK (Thr202\/Tyr204) a p-Akt (Ser473 a Thr308) z 10 na 20\u2009min; Obr. 4a, vpravo ). Dr\u00e1hy MAPK a Akt mohli by\u0165 v bunk\u00e1ch SUM159 upregulovan\u00e9 v d\u00f4sledku uvo\u013enenia negat\u00edvnej regula\u010dnej sp\u00e4tnov\u00e4zbovej slu\u010dky, ktor\u00e1 sp\u00fa\u0161\u0165a signaliz\u00e1ciu ERK na ochranu buniek pred apoptotickou bunkovou smr\u0165ou8,49. Anti-melit\u00ednov\u00e1 protil\u00e1tka indikovala zvy\u0161uj\u00face sa mno\u017estvo melit\u00ednu pr\u00edtomn\u00e9ho v lyz\u00e1toch oboch bunkov\u00fdch l\u00edni\u00ed v priebehu \u010dasu, so silnej\u0161\u00edm sign\u00e1lom pre o\u0161etrenie melit\u00ednom v porovnan\u00ed s v\u010del\u00edm jedom v oboch bunkov\u00fdch l\u00edni\u00e1ch.<\/p>\n\n\n\n Aby sme charakterizovali \u00fa\u010dinky na sign\u00e1lne dr\u00e1hy v inom modeli TNBC, uskuto\u010dnili sme imunoblotting na bunk\u00e1ch MDA-MB-231, v ktor\u00fdch lie\u010dba EGF fosforylovala EGFR a vyvolala expresiu EGFR (doplnkov\u00fd obr\u00e1zok 4). Melitt\u00edn zni\u017eoval fosforyl\u00e1ciu EGFR a MAPK, \u010d\u00edm nadol reguloval hlavn\u00e9 dr\u00e1hy onkog\u00e9nnej prolifer\u00e1cie. Na rozdiel od buniek SUM159 stimul\u00e1cia EGFR pomocou EGF nekorelovala so zv\u00fd\u0161en\u00edm fosforyl\u00e1cie v p-Akt, potenci\u00e1lne v d\u00f4sledku odpojenia medzi signaliz\u00e1ciou EGFR a dr\u00e1hami Akt. In\u00e9 receptory rastov\u00fdch faktorov, ako je VEGFR1, m\u00f4\u017eu sprostredkova\u0165 aktiv\u00e1ciu t\u00fdchto dr\u00e1h50,51. Zatia\u013e \u010do melit\u00edn predt\u00fdm inhiboval signaliz\u00e1ciu JAK2 \/ STAT3 pri rakovine vaje\u010dn\u00edkov12, nepozorovali sa \u017eiadne modula\u010dn\u00e9 \u00fa\u010dinky na inhib\u00edtory dr\u00e1hy JAK \/ STAT v bunk\u00e1ch SUM159 po 60-min\u00fatovom o\u0161etren\u00ed v\u010del\u00edm jedom alebo melit\u00ednom (doplnkov\u00fd obr\u00e1zok 5).<\/p>\n\n\n\n Vzh\u013eadom na to, \u017ee bunky karcin\u00f3mu prsn\u00edka obohaten\u00e9 o TNBC a HER2 s\u00fa vysoko z\u00e1visl\u00e9 od aktiv\u00e1cie EGFR a HER2, uskuto\u010dnili sme experimenty s bioluminiscen\u010dn\u00fdm rezonan\u010dn\u00fdm prenosom energie (BRET), aby sme ur\u010dili, \u010di melit\u00edn interferuje s v\u00e4zbou EGF na EGFR, \u010do vedie k pozorovan\u00e9mu potla\u010deniu rastu. fosforyl\u00e1cia receptora faktora. Report\u00e9r NanoLuc sa pou\u017eil ako bioluminiscen\u010dn\u00e1 donorov\u00e1 molekula a geneticky sa spojil s EGFR52,53. Kinetick\u00e9 a satura\u010dn\u00e9 BRET experimenty sa pou\u017eili na monitorovanie bl\u00edzkosti NanoLuc-EGFR s fluorescen\u010dne ozna\u010den\u00fdmi akceptorov\u00fdmi molekulami TAMRA-EGF (pozit\u00edvna kontrola), FITC-melit\u00edn a FITC-DEDE-melit\u00edn (negat\u00edvna kontrola) v bunk\u00e1ch HEK293FT transfekovan\u00fdch NanoLuc- EGFR. K prenosu energie z bioluminiscen\u010dn\u00e9ho donoru na fluorescen\u010dn\u00fd akceptor doch\u00e1dza na vzdialenosti men\u0161ie ako 10 nm a sved\u010d\u00ed o interakci\u00e1ch medzi sledovan\u00fdmi ozna\u010den\u00fdmi molekulami54. Sign\u00e1l BRET sa ur\u010duje monitorovan\u00edm pomeru emisie svetla z akceptora k emisii z darcu.<\/p>\n\n\n\n Vybral sa rozsah koncentr\u00e1ci\u00ed ka\u017ed\u00e9ho peptidu, vr\u00e1tane IC50 FITC-melitt\u00ednu, so zodpovedaj\u00facimi mol\u00e1rnymi koncentr\u00e1ciami FITC-DEDE-melit\u00ednu. Zistili sme, \u017ee sign\u00e1l BRET sa zv\u00fd\u0161il v z\u00e1vislosti od d\u00e1vky pre TAMRA-EGF a FITC-DEDE-melit\u00edn a v men\u0161ej miere pre FITC-melit\u00edn (obr. 4b). FITC-DEDE-melit\u00edn vykazoval ove\u013ea vy\u0161\u0161ie pomery BRET ako FITC-melit\u00edn pri rovnak\u00fdch koncentr\u00e1ci\u00e1ch, ako aj ve\u013emi r\u00fdchlo dosahoval maxim\u00e1lne pomery BRET pri ka\u017edej d\u00e1vke. Ne\u0161pecifick\u00fd peptid navrhnut\u00fd proti transkrip\u010dn\u00e9mu faktoru Engrailed 1 (EN1)55 (FITC-EN1-mutant) vykazoval podobn\u00e9 pomery BRET a kinetiku ako FITC-DEDE-melit\u00edn (doplnkov\u00fd obr\u00e1zok 6), \u010do nazna\u010duje, \u017ee na zistenie \u0161pecificity boli potrebn\u00e9 \u010fal\u0161ie experimenty. v\u00e4zbov\u00e9 interakcie s EGFR.<\/p>\n\n\n\n Aby sme ur\u010dili \u0161pecificitu v\u00e4zby melitt\u00ednu na EGFR na v\u00e4zbovom mieste EGF, uskuto\u010dnili sme satura\u010dn\u00e9 BRET testy na vyhodnotenie kompet\u00edcie EGF s ka\u017ed\u00fdm z peptidov via\u017eucich sa na NanoLuc-EGFR (obr. 4c). Zatia\u013e \u010do v\u00e4zba TAMRA-EGF na NanoLuc-EGFR bola saturovate\u013en\u00e1 a v\u00fdznamne zn\u00ed\u017een\u00e1 v pr\u00edtomnosti 1\u2009uM EGF (dvojcestn\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,0001), sign\u00e1ly BRET melit\u00ednu FITC a melit\u00ednu FITC-DEDE neboli saturovate\u013en\u00e9 a sa v\u00fdznamne nel\u00ed\u0161ia s alebo bez 1\u2009uM EGF (dvojcestn\u00e1 ANOVA, p\u2009>\u20090,999), \u010do nazna\u010duje, \u017ee ani melit\u00edn, ani DEDE-melit\u00edn sa nevia\u017eu na EGF-v\u00e4zbov\u00e9 miesto.<\/p>\n\n\n\n Na\u0161e \u00fadaje podporuj\u00fa n\u00e1zor, \u017ee melit\u00edn sa za\u010dle\u0148uje do plazmatickej membr\u00e1ny rakovinov\u00fdch buniek prostredn\u00edctvom nabitej sekvencie pr\u00edtomnej na C-konci, \u010do vyvol\u00e1va remodel\u00e1ciu a rozru\u0161enie plazmatickej membr\u00e1ny. \u00dadaje BRET nazna\u010duj\u00fa, \u017ee melit\u00edn m\u00f4\u017ee by\u0165 umiestnen\u00fd vo vzdialenosti do 10 nm od RTK bez toho, aby interferoval s v\u00e4zbov\u00fdm miestom endog\u00e9nneho rastov\u00e9ho faktora (obr. 4d).<\/p>\n\n\n\n Melitt\u00edn senzibilizuje TNBC na lie\u010dbu docetaxelom in vivo Obr. 5: Melitt\u00edn senzibilizuje vysoko agres\u00edvne n\u00e1dory TNBC na lie\u010dbu docetaxelom in vivo.<\/p>\n\n\n\n Aby sme presk\u00famali \u00fa\u010dinnos\u0165 kombin\u00e1cie melit\u00ednu a docetaxelu pri zni\u017eovan\u00ed rastu TNBC, uskuto\u010dnili sme in vivo experimenty transplant\u00e1ciou buniek T11 do my\u0161\u00ed BALB\/c. Tento model alo\u0161tepu rekapituluje vysoko agres\u00edvne ochorenie TNBC s n\u00edzkym obsahom klaud\u00ednu u my\u0161\u00ed s intaktn\u00fdm imunitn\u00fdm syst\u00e9mom38, 57, 58. Tri dni po vytvoren\u00ed n\u00e1dorov T11 (~50\u2009mm3) boli my\u0161i n\u00e1hodne rozdelen\u00e9 do \u0161tyroch skup\u00edn (n\u2009=\u200912 my\u0161\u00ed\/skupina) a intratumor\u00e1lne lie\u010den\u00e9 vehikulom, melit\u00ednom (5\u2009mg\/kg), docetaxelom (7\u2009mg\/kg), alebo kombin\u00e1cia melitt\u00ednu (5\u2009mg\/kg) a docetaxelu (7\u2009mg\/kg). My\u0161i boli lie\u010den\u00e9 ka\u017ed\u00e9 2 dni od 3. d\u0148a, celkovo 7 lie\u010den\u00ed. Zistili sme, \u017ee pri kombinovanej lie\u010dbe bola kontrola n\u00e1doru lep\u0161ia v porovnan\u00ed s lie\u010dbou samotnou alebo vehikulom, najm\u00e4 v d\u0148och 7 a 9 po inokul\u00e1cii buniek T11, pri\u010dom t\u00e1to kombin\u00e1cia dosiahla v\u00fdznamn\u00e9 zn\u00ed\u017eenie objemu n\u00e1doru (obr. 5c, jednosmern\u00fd ANOVA, p\u2009<\u20090,001). To nazna\u010duje, \u017ee n\u00e1dory rezistentn\u00e9 na docetaxel by sa mohli sta\u0165 citliv\u00fdmi pridan\u00edm melit\u00ednu. Tieto \u0161t\u00fadie sme overili bioluminiscen\u010dn\u00fdm zobrazovan\u00edm (BLI), aby sme neinvaz\u00edvne sledovali zmeny v raste n\u00e1doru in vivo v bunk\u00e1ch T11 ozna\u010den\u00fdch kon\u0161truktom obsahuj\u00facim lucifer\u00e1zu (obr. 5d). Tu sme op\u00e4\u0165 zistili zlep\u0161en\u00fa kontrolu n\u00e1doru pri kombinovanej lie\u010dbe docetaxelom a melitt\u00ednom na 10., 12. a 14. de\u0148 v porovnan\u00ed so v\u0161etk\u00fdmi ostatn\u00fdmi skupinami.<\/p>\n\n\n\n Terapeutick\u00e9 \u00fa\u010dinky melit\u00ednu a docetaxelu boli overen\u00e9 v n\u00e1dorov\u00fdch tkaniv\u00e1ch 14. de\u0148 po inokul\u00e1cii buniek T11 imunohistoch\u00e9miou a imunofluorescenciou (obr. 5e). Protil\u00e1tka proti melit\u00ednu potvrdila intratumor\u00e1lnu lokaliz\u00e1ciu buniek pozit\u00edvnych na melit\u00edn v skupine s melit\u00ednom (61,9\u2009\u00b1\u20090,7 %) aj v skupine s kombinovanou lie\u010dbou (55,8\u2009\u00b1\u20091,3 %), ale nie v kontrolnej skupine s vehikulom (jednosmern\u00e1 ANOVA, p. <\u20090,01, priemer\u2009\u00b1\u2009SEM). V\u00fdznamn\u00e9 zn\u00ed\u017eenie prolifer\u00e1cie n\u00e1dorov\u00fdch buniek (hodnoten\u00e9 expresiou Ki-67) sa zistilo v n\u00e1doroch lie\u010den\u00fdch kombin\u00e1ciou melit\u00ednu a docetaxelu (5,7\u2009\u00b1\u20090,8 %) v porovnan\u00ed s vehikulom (59,8\u2009\u00b1\u20091,7 %) v porovnan\u00ed s ktor\u00fdmko\u013evek melit\u00ednom ( 31,7\u2009\u00b1\u20091,3 %) alebo samotn\u00fd docetaxel (21,0\u2009\u00b1\u20091,3 %, jednosmern\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,01, priemer\u2009\u00b1\u2009SEM). Farbenie TUNEL potvrdilo v\u00fdznamne vy\u0161\u0161iu fragment\u00e1ciu DNA a indukciu apopt\u00f3zy v skupine s kombin\u00e1ciou (81,0\u2009\u00b1\u20093,1 %) v porovnan\u00ed s vehikulom (1,0\u2009\u00b1\u20090,4 %, jednosmern\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,01, priemer\u2009\u00b1\u2009SEM).<\/p>\n\n\n\n Ligand-1 programovanej smrti prote\u00ednu imunitn\u00e9ho kontroln\u00e9ho bodu (PD-L1) zni\u017euje funk\u010dnos\u0165 aktivovan\u00fdch T buniek. V d\u00f4sledku toho blok\u00e1dy imunitn\u00fdch kontroln\u00fdch bodov v kombin\u00e1cii s chemoterapiou zabra\u0148uj\u00fa rozpoznaniu PD-L1 T-buniek, \u010d\u00edm zabra\u0148uj\u00fa tejto adapt\u00edvnej imunitnej rezistencii v TNBC, a t\u00fdm zvy\u0161uj\u00fa terapeutick\u00fa \u00fa\u010dinnos\u0165 oproti samotnej chemoterapii59. Na rozdiel od samotn\u00e9ho docetaxelu (84,3\u2009\u00b1\u20090,6 %), ktor\u00fd neovplyvnil hladiny PD-L1 v n\u00e1doroch, zistili sme, \u017ee melitt\u00edn v\u00fdznamne zn\u00ed\u017eil expresiu PD-L1 v n\u00e1doroch, ke\u010f sa pou\u017eil samostatne (52,9\u2009\u00b1\u20092,4 %) alebo v kombin\u00e1cii lie\u010dba (44,3\u2009\u00b1\u20094,2 %) v porovnan\u00ed s vehikulom (84,9\u2009\u00b1\u20091,6 %, jednosmern\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,01, priemer\u2009\u00b1\u2009SEM). Stru\u010dne povedan\u00e9, tieto \u0161t\u00fadie podporuj\u00fa n\u00e1zor, \u017ee melit\u00edn senzibilizuje bunky T11 na lie\u010dbu docetaxelom a \u017ee melit\u00edn by mohol pom\u00f4c\u0165 zmierni\u0165 expresiu prote\u00ednov kontroln\u00fdch bodov imunity, \u010d\u00edm by sa n\u00e1sledne zlep\u0161ili protin\u00e1dorov\u00e9 imunitn\u00e9 reakcie.<\/p>\n\n\n\n \u010ealej sme vykonali imunohistoch\u00e9miu v lie\u010den\u00fdch n\u00e1doroch T11 na detekciu p-HER2 (Tyr1248) a p-EGFR (Tyr1068) (doplnkov\u00fd obr\u00e1zok 9). Expresia EGFR bola mierne, ale v\u00fdznamne zn\u00ed\u017een\u00e1 kombin\u00e1ciou melitt\u00ednu a docetaxelu (75,8\u2009\u00b1\u20096,4 %) v porovnan\u00ed s vehikulom (100,0\u2009\u00b1\u20099,1 %, jednosmern\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,05, priemer\u2009\u00b1\u2009SEM). Expresia HER2 sa v\u00fdznamne nel\u00ed\u0161ila vo v\u0161etk\u00fdch lie\u010debn\u00fdch skupin\u00e1ch (jednosmern\u00e1 ANOVA, p\u2009=\u20090,1536). V pr\u00edpade p-EGFR (Tyr1068) bola fosforyl\u00e1cia zn\u00ed\u017een\u00e1 na v\u00fdrazne ni\u017e\u0161iu \u00farove\u0148 kombinovanou lie\u010dbou melitt\u00ednom a docetaxelom (9,0\u2009\u00b1\u20092,4 %) v porovnan\u00ed s vehikulom (100,0\u2009\u00b1\u20098,1 %, jednosmern\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,0001, priemer SEM). Hladiny p-HER2 (Tyr1248) boli tie\u017e zn\u00ed\u017een\u00e9 na v\u00fdznamne ni\u017e\u0161iu \u00farove\u0148 pri kombinovanej lie\u010dbe melitt\u00ednom a docetaxelom (50,3\u2009\u00b1\u20097,8 %) v porovnan\u00ed s vehikulom (100,0\u2009\u00b1\u20095,6 %, jednosmern\u00e1 ANOVA, p\u2009<\u20090,0001, priemer \u2009 \u00b1 0,0001, SEM). Pokles fosforyl\u00e1cie EGFR a HER2 in vivo po lie\u010dbe melit\u00ednom je v s\u00falade s pozorovan\u00fdmi \u00fa\u010dinkami melit\u00ednu pri zni\u017eovan\u00ed fosforyl\u00e1cie t\u00fdchto RTK v bunk\u00e1ch SKBR3, SUM159 a MDA-MB-231 (obr. 4a; doplnkov\u00fd obr\u00e1zok 4).<\/p>\n\n\n\n Diskusia<\/strong> Terapia anti-HER2 podstatne zlep\u0161ila dlhodob\u00e9 pre\u017e\u00edvanie v skor\u00fdch \u0161t\u00e1di\u00e1ch HER2-pozit\u00edvnych rakov\u00edn, ale u v\u00e4\u010d\u0161iny pacientov v neskorom \u0161t\u00e1diu sa nakoniec vyvinula rezistencia a pod\u013eahli ochoreniu33,35,36. Nielen\u017ee sme preuk\u00e1zali selektivitu v\u010delieho jedu a melit\u00ednu pre mal\u00edgne bunky, ale odhalili sme aj vy\u0161\u0161iu potenciu pre tieto agres\u00edvne typy rakoviny prsn\u00edka.<\/p>\n\n\n\n Tu ukazujeme, \u017ee v\u010del\u00ed jed a melit\u00edn potl\u00e1\u010daj\u00fa ligandom indukovan\u00fa fosforyl\u00e1ciu EGFR a HER2, \u010d\u00edm dynamicky moduluj\u00fa downstream sign\u00e1lne dr\u00e1hy v bunk\u00e1ch rakoviny prsn\u00edka. Navrhujeme, aby melit\u00edn priamo alebo nepriamo inhiboval dimeriz\u00e1ciu RTK. Melit\u00edn m\u00f4\u017ee tie\u017e vst\u00fapi\u0165 do bunky, aby priamo alebo nepriamo moduloval downstream sign\u00e1lne dr\u00e1hy25,60. Predch\u00e1dzaj\u00faca pr\u00e1ca uk\u00e1zala, \u017ee melit\u00edn m\u00f4\u017ee by\u0165 zacielen\u00fd na bunkov\u00e9 l\u00ednie nadmerne exprimuj\u00face HER2 pomocou imunolipoz\u00f3mov nes\u00facich trastuzumab61. Tu demon\u0161trujeme, \u017ee samotn\u00fd melit\u00edn sa selekt\u00edvne zameriava na bunky rakoviny prsn\u00edka nadmerne exprimuj\u00face HER2 a EGFR. Je zauj\u00edmav\u00e9, \u017ee melit\u00edn bol pre bunky rakoviny prsn\u00edka toxickej\u0161\u00ed v porovnan\u00ed s v\u010del\u00edm jedom, \u010do si vy\u017eaduje \u010fal\u0161ie sk\u00famanie.<\/p>\n\n\n\n V na\u0161ej \u0161t\u00fadii sme sa zamerali na bunkov\u00e9 l\u00ednie SUM159 a SKBR3. SUM159 je bunkov\u00e1 l\u00ednia TNBC, ktor\u00e1 exprimuje g\u00e9nov\u00fd produkt EGFR a obsahuje mut\u00e1cie missense v PI3KCA (H1047L) a v HRAS (G12D)62,63. Naopak, SUM159 je KRAS, NRAS, BRAF, PTEN a MAP2K4 divok\u00e9ho typu a negat\u00edvny na aktiv\u00e1ciu AKT1 a amplifik\u00e1ciu AKT2 a AKT363. SKBR3 je HER2-obohaten\u00e1 bunkov\u00e1 l\u00ednia rakoviny prsn\u00edka, ktor\u00e1 nadmerne exprimuje HER2 g\u00e9nov\u00fd produkt64 a je KRAS, HRAS, NRAS, BRAF, PTEN, PI3KCA a MAP2K4 divok\u00e9ho typu63,65,66 a tie\u017e negat\u00edvna na aktiv\u00e1ciu AKT1 a AKT2 a AKT3 zosilnenie63. Ber\u00fac do \u00favahy tieto molekul\u00e1rne charakteristiky, downstream sign\u00e1lne dr\u00e1hy EGFR nie s\u00fa kon\u0161titut\u00edvne aktivovan\u00e9 v bunk\u00e1ch SUM159, napriek existuj\u00facim mut\u00e1ci\u00e1m v HRAS a PI3KCA, preto\u017ee nie s\u00fa dostato\u010dn\u00e9 na baz\u00e1lnu aktiv\u00e1ciu t\u00fdchto dr\u00e1h67.<\/p>\n\n\n\n Uv\u00e1dzame siln\u00fa a synergick\u00fa protin\u00e1dorov\u00fa odpove\u010f s melit\u00ednom a docetaxelom vo vysoko agres\u00edvnom modeli TNBC in vivo. To zd\u00f4raz\u0148uje potenci\u00e1l melitt\u00ednu na pou\u017eitie v kombinovan\u00fdch terapi\u00e1ch na potenci\u00e1lne zv\u00fd\u0161enie \u00fa\u010dinnosti a\/alebo zn\u00ed\u017eenie d\u00e1vky cytotoxick\u00fdch \u010dinidiel, \u010do umo\u017e\u0148uje dodanie n\u00e1kladovo efekt\u00edvnej\u0161ej lie\u010dby s potenci\u00e1lne men\u0161\u00edmi ved\u013eaj\u0161\u00edmi \u00fa\u010dinkami. Melittin tie\u017e zn\u00ed\u017eil hladiny prote\u00ednu PD-L1 imunitn\u00e9ho kontroln\u00e9ho bodu, ktor\u00fd sa podie\u013ea na vyh\u00fdban\u00ed sa imunite. Melitt\u00edn by teda mohol zn\u00ed\u017ei\u0165 imunosupres\u00edvne \u00fa\u010dinky n\u00e1dorov\u00e9ho mikroprostredia, ktor\u00e9 prevl\u00e1daj\u00fa v TNBC v pr\u00edtomnosti chemoterapie. To prid\u00e1va k \u00fadajom z predch\u00e1dzaj\u00facich spr\u00e1v, ktor\u00e9 ukazuj\u00fa, \u017ee melit\u00edn m\u00f4\u017ee tie\u017e zn\u00ed\u017ei\u0165 popul\u00e1ciu makrof\u00e1gov s\u00favisiacich s n\u00e1dorom typu M2 v mikroprostred\u00ed n\u00e1doru v modeli karcin\u00f3mu p\u013e\u00fac68. Predpoklad\u00e1me, \u017ee v na\u0161om in vivo modeli T11 m\u00f4\u017ee signaliz\u00e1cia EGFR a HER2 modulova\u0165 expresiu PD-L1 v n\u00e1dorov\u00fdch bunk\u00e1ch. Pod\u013ea predch\u00e1dzaj\u00facich imunohistochemick\u00fdch \u0161t\u00fadi\u00ed m\u00e1 PD-L1 najvy\u0161\u0161iu expresiu v n\u00e1doroch TNBC, po ktor\u00fdch nasleduj\u00fa n\u00e1dory obohaten\u00e9 o HER269,70,71,72 a expresia PD-L1 je spojen\u00e1 so slab\u00fdm pre\u017eit\u00edm69. Pri baz\u00e1lnych rakovin\u00e1ch prsn\u00edka sa uk\u00e1zalo, \u017ee nepr\u00edtomnos\u0165 prote\u00ednu ALIX koreluje s aktiv\u00e1ciou EGFR, \u010do zhor\u0161uje biogen\u00e9zu exoz\u00f3mov73. PD-L1 sa vylu\u010duje prostredn\u00edctvom exoz\u00f3mov sp\u00f4sobom z\u00e1visl\u00fdm od ALIX, tak\u017ee po\u0161kodenie exoz\u00f3mov zvy\u0161uje PD-L1 na bunkovej membr\u00e1ne. Downregul\u00e1cia ALIX podporuje pre\u017eitie n\u00e1doru zv\u00fd\u0161en\u00edm aktiv\u00e1cie EGFR a akumul\u00e1ciou membr\u00e1ny PD-L1, \u010do vedie k imunosupresii73. Pri rakovine prsn\u00edka obohatenej o HER2 je presluch medzi HER2 a PD-L1 nedostato\u010dne pochopen\u00fd74. Av\u0161ak v HER2-pozit\u00edvnych bunk\u00e1ch rakoviny prsn\u00edka kokultivovan\u00fdch s \u013eudsk\u00fdmi mononukle\u00e1rnymi bunkami perif\u00e9rnej krvi a na my\u0161om modeli viedla terapia trastuzumabom proti HER2 k upregul\u00e1cii PD-L175,76. Preto by inkorpor\u00e1cia melitt\u00ednu s trastuzumabom mohla zru\u0161i\u0165 t\u00fato imunosupres\u00edvnu reakciu.<\/p>\n\n\n\n Selektivita melit\u00ednu pre n\u00e1dory riaden\u00e9 HER2 tie\u017e predstavuje \u010fal\u0161\u00ed d\u00f4vod na kombin\u00e1ciu s l\u00e1tkami zameran\u00fdmi na HER2, vr\u00e1tane monoklon\u00e1lnych protil\u00e1tok, trastuzumab-emtans\u00ednu a in\u00fdch konjug\u00e1tov protil\u00e1tka-lie\u010divo, kde by vlastnosti melit\u00ednu naru\u0161uj\u00face membr\u00e1ny mohli zv\u00fd\u0161i\u0165 kinetiku internaliz\u00e1cie cytotoxick\u00e9 za\u0165a\u017eenie. Na\u0161a pr\u00e1ca tie\u017e odha\u013euje nov\u00e9 pr\u00edle\u017eitosti na modifik\u00e1ciu \u0161pecifick\u00fdch oblast\u00ed melit\u00ednu, aby sa \u010falej zv\u00fd\u0161ila \u00fa\u010dinnos\u0165 a cielen\u00e1 \u0161pecifickos\u0165 pre mal\u00edgne bunky. Upraven\u00e9 cielen\u00e9 peptidy, ako je RGD1-melitt\u00edn, by sa mohli pod\u00e1va\u0165 intraven\u00f3zne, aby sa umo\u017enilo selekt\u00edvnej\u0161ie nav\u00e1dzanie a pr\u00edjem do n\u00e1dorov\u00fdch buniek. Melitt\u00edn by sa mohol dod\u00e1va\u0165 aj prostredn\u00edctvom cielen\u00fdch nano\u010dasticov\u00fdch pr\u00edstupov, ako s\u00fa tie, ktor\u00e9 boli predt\u00fdm hl\u00e1sen\u00e9 u \u201enanov\u010diel\u201c77,78. Mohlo by sa tie\u017e vyu\u017ei\u0165 prepojenie melit\u00ednu s tox\u00ednmi alebo prolie\u010divami, ako sa uv\u00e1dza pri f\u00fazi\u00e1ch melitt\u00ednu \u0161tiepite\u013en\u00fdch uPA79. Pred pokusmi na \u013eu\u010foch bud\u00fa potrebn\u00e9 bud\u00face \u0161t\u00fadie na form\u00e1lne pos\u00fadenie toxicity a maxim\u00e1lnych tolerovan\u00fdch d\u00e1vok t\u00fdchto peptidov.<\/p>\n\n\n\n V\u010del\u00ed jed je celosvetovo dostupn\u00fd a pon\u00faka n\u00e1kladovo efekt\u00edvne a \u013eahko dostupn\u00e9 mo\u017enosti lie\u010dby v od\u013eahl\u00fdch alebo menej rozvinut\u00fdch regi\u00f3noch. Bude potrebn\u00fd \u010fal\u0161\u00ed v\u00fdskum na pos\u00fadenie, \u010di jed niektor\u00fdch genotypov v\u010diel m\u00e1 silnej\u0161ie alebo \u0161pecifickej\u0161ie protirakovinov\u00e9 aktivity, ktor\u00e9 by sa potom dali vyu\u017ei\u0165. Okrem rakoviny prsn\u00edka n\u00e1dory nadmerne exprimuj\u00face EGFR zah\u0155\u0148aj\u00fa rakovinu p\u013e\u00fac, glioblast\u00f3m a kolorekt\u00e1lny karcin\u00f3m80 a n\u00e1dory, ktor\u00e9 m\u00f4\u017eu nadmerne exprimova\u0165 HER2, zah\u0155\u0148aj\u00fa rakovinu \u017eal\u00fadka, vaje\u010dn\u00edkov, endometria, mo\u010dov\u00e9ho mech\u00fara, p\u013e\u00fac, hrub\u00e9ho \u010dreva a hlavy a krku81. Celkovo by sa na\u0161e v\u00fdsledky mohli vyu\u017ei\u0165 na pomoc pri v\u00fdvoji nov\u00fdch terapeutick\u00fdch modal\u00edt pre mnoh\u00e9 typy rakoviny spojen\u00e9 s \u010dastou rezistenciou na lieky a zlou progn\u00f3zou.<\/p>\n\n\n\n Met\u00f3dy Zber v\u010delieho jedu \u017d\u013eazov\u00fd jed sa odobral manu\u00e1lnou disekciou. V\u010dely boli odchyten\u00e9 v bl\u00edzkosti vchodu do \u00fa\u013ea pre v\u010dely alebo priamo z kol\u00f3nie pre \u010dmeliaky a anestetizovan\u00e9 oxidom uhli\u010dit\u00fdm a ochladen\u00e9 na \u013eade. Z ka\u017ed\u00e9ho jedinca bol vypreparovan\u00fd bodac\u00ed apar\u00e1t; potom sa odstr\u00e1nila jedov\u00e1 \u017e\u013eaza a umiestnila sa do fosf\u00e1tom pufrovan\u00e9ho fyziologick\u00e9ho roztoku (PBS). \u017d\u013eazy boli prepichnut\u00e9 ihlou Terumo (25\u2009G \u00d7 5\/8) a odstreden\u00e9 (13 000 g, 10\u2009min, 4 \u00b0C) a supernatant bol odobrat\u00fd, obsahuj\u00faci jed v kvapalnej suspenzii. Koncentr\u00e1cia prote\u00ednu ka\u017edej hlavnej zmesi bola kvantifikovan\u00e1 pomocou prote\u00ednov\u00e9ho testu kompatibiln\u00e9ho s detergentom (Bio-Rad), meran\u00edm absorbancie pri 750 nm pomocou Millennium Science BioTek PowerWave XS2 (Gen 5 1.11 Software, Verzia 1.11.5). Ka\u017ed\u00e1 hlavn\u00e1 zmes sa potom rozdelila na alikv\u00f3ty a skladovala pri -80 \u00b0C.<\/p>\n\n\n\n Bunkov\u00e9 l\u00ednie a kultiva\u010dn\u00e9 podmienky Bunky boli inkubovan\u00e9 pri 37 \u00b0 C a 5 % CO2 a doplnen\u00e9 1 % antibiotikom-antimykotikom. HDFa (norm\u00e1lne prim\u00e1rne dospel\u00e9 \u013eudsk\u00e9 derm\u00e1lne fibroblasty) bunky sa kultivovali v DMEM s 10 % fet\u00e1lnym bovinn\u00fdm s\u00e9rom (FBS). MCF 10A a MCF-12A (imortalizovan\u00e9 epitelov\u00e9 bunky \u013eudskej mlie\u010dnej \u017e\u013eazy, netransformovan\u00e9) sa udr\u017eiavali v DMEM\/F-12 s doplnkami (5 % fet\u00e1lne konsk\u00e9 s\u00e9rum, 20\u2009ng\/ml epiderm\u00e1lny rastov\u00fd faktor, 10\u2009\u03bcg\/\u03bcl inzul\u00edn, 100\u2009ng\/ml tox\u00edn cholery a 500 ng\/ml hydrokortiz\u00f3nu). Bunky NIH\/3T3 (my\u0161ie embryon\u00e1lne fibroblasty) sa udr\u017eiavali v DMEM s 10 % FBS. HEK293FT (bunky 293 \u013eudsk\u00fdch embryon\u00e1lnych obli\u010diek stabilne exprimuj\u00face SV40 ve\u013ek\u00fd T antig\u00e9n) sa kultivoval v DMEM s 10 % FBS a doplnkami (1 % glutam\u00edn a 0,4 mg\/ml G418 Geneticin, Gibco). MCF7 (\u013eudsk\u00fd lumin\u00e1lny A karcin\u00f3m prsn\u00edka) sa udr\u017eiaval v MEM a s 10 % FBS a doplnkami (po 1 % pyruv\u00e1t sodn\u00fd, hydrogenuhli\u010ditan sodn\u00fd a neesenci\u00e1lne aminokyseliny). T-47D a ZR-75-1 (obe \u013eudsk\u00e9 lumin\u00e1lna A rakovina prsn\u00edka) sa kultivovali v RPMI s 10 % FBS. MDA-MB-231 (\u013eudsk\u00fd karcin\u00f3m prsn\u00edka s n\u00edzkym obsahom klaud\u00ednu) sa kultivoval v DMEM s 10 % FBS. SUM149 (\u013eudsk\u00fd baz\u00e1lny karcin\u00f3m prsn\u00edka) bol kultivovan\u00fd v F-12 s 10 % FBS. SUM159 (\u013eudsk\u00fd karcin\u00f3m prsn\u00edka s n\u00edzkym obsahom klaud\u00ednu) bol kultivovan\u00fd v F-12 s 5% FBS a doplnkami (5\u2009\u03bcg\/ml inzul\u00ednu a 1\u2009\u03bcg\/ml hydrokortiz\u00f3nu). MDA-MB-453 (rakovina prsn\u00edka obohaten\u00e1 o \u013eudsk\u00fd HER2) sa kultivovala v DMEM s 10 % FBS. SKBR3 (rakovina prsn\u00edka obohaten\u00e1 o \u013eudsk\u00fd HER2) sa kultivovala v RPMI s 10 % FBS a 1 % pyruv\u00e1tom sodn\u00fdm. p53-T11 (my\u0161\u00ed karcin\u00f3m prsn\u00edka s n\u00edzkym obsahom klaud\u00ednu) sa udr\u017eiaval v m\u00e9diu RPMI 1640 s 10 % FBS. BRCA\u2212 B.15 (my\u0161\u00ed baz\u00e1lny karcin\u00f3m prsn\u00edka) sa udr\u017eiaval v m\u00e9diu RPMI 1640 s 10 % FBS.<\/p>\n\n\n\n Testy bunkovej \u017eivotaschopnosti Produkcia prim\u00e1rnej monoklon\u00e1lnej protil\u00e1tky proti melit\u00ednu Enzymovo viazan\u00fd imunosorbentov\u00fd test (ELISA) Kompeti\u010dn\u00e9 experimenty anti-melitt\u00ednov\u00fdch protil\u00e1tok Western blot Prietokov\u00e1 cytometria Mikroskopia \u017eiv\u00fdch buniek Skenovacia elektr\u00f3nov\u00e1 mikroskopia Imunofluorescencia Bioluminiscen\u010dn\u00fd rezonan\u010dn\u00fd prenos energie (BRET) Pre experimenty s kinetikou asoci\u00e1cie ligandov v re\u00e1lnom \u010dase sa m\u00e9dium odstr\u00e1nilo z buniek, ktor\u00e9 sa potom inkubovali s 50\u2009\u03bcl\/jamku NanoLuc substr\u00e1tu furimaz\u00ednu do kone\u010dnej koncentr\u00e1cie 10\u2009\u03bcM zrieden\u00e9ho v Hankovom vyv\u00e1\u017eenom so\u013enom roztoku (HBSS). Bunky sa potom ekvilibrovali v \u010d\u00edta\u010dke platn\u00ed CLARIOstar (BMG Labtech, Austr\u00e1lia) po\u010das 5 min\u00fat, aby sa zaznamenali baz\u00e1lne hodnoty. Ligandy (TAMRA-EGF, FITC-melit\u00edn a FITC-DEDE-melitt\u00edn) sa potom pridali do rozsahu spr\u00e1vnych kone\u010dn\u00fdch koncentr\u00e1ci\u00ed a z\u00e1znamy NanoBRET sa robili ka\u017ed\u00fdch 90 s po\u010das 60 min\u00fat pri 37 \u00b0C. Pre satura\u010dn\u00e9 experimenty sa m\u00e9dium z buniek odstr\u00e1nilo a pridal sa rozsah koncentr\u00e1ci\u00ed TAMRA-EGF, FITC-melitt\u00edn a FITC-DEDE-melitt\u00edn v pr\u00edtomnosti alebo nepr\u00edtomnosti konkuren\u010dnej koncentr\u00e1cie (1\u2009uM) nezna\u010den\u00e9ho EGF. a inkubovan\u00e9 pri 37 \u00b0C po\u010das 60 min\u00fat v tme. Furimaz\u00edn sa pridal v kone\u010dnej koncentr\u00e1cii 10-uM. Nahr\u00e1vky boli uroben\u00e9 pomocou LUMIstar Omega (BMG Labtech, Austr\u00e1lia). \u00dadaje s\u00fa prezentovan\u00e9 ako \u201esurov\u00fd pomer BRET\u201c, odvoden\u00fd z pomeru dlhovlnnej emisie (akceptor) k emisii s kr\u00e1tkou vlnovou d\u013a\u017ekou (donora). Experimenty sa uskuto\u010d\u0148ovali v biologick\u00fdch replik\u00e1toch (n\u2009=\u20093).<\/p>\n\n\n\n Anal\u00fdza kombinovan\u00fdch \u00fa\u010dinkov liekov Zvierac\u00ed model a lie\u010dba Imunohistochemick\u00e1 anal\u00fdza n\u00e1dorov Bioluminiscen\u010dn\u00e9 zobrazovanie \u0160tatistick\u00e1 anal\u00fdza S\u00fahrn preh\u013eadov Dostupnos\u0165 \u00fadajov Hist\u00f3ria zmien<\/p>\n\n\n\n![\"\"](\"http:\/\/apitoxin.sk\/wp-content\/uploads\/2022\/07\/2-1024x445.png\")
<\/strong>Na presk\u00famanie mechanizmu a kinetiky bunkovej smrti boli bunky TNBC o\u0161etren\u00e9 IC50 bu\u010f v\u010del\u00edm jedom alebo melitt\u00ednom po\u010das 18 a 24 hod\u00edn a spracovan\u00e9 testom \u0161tiepenej kasp\u00e1zy-3 na kvantifik\u00e1ciu apoptotickej bunkovej smrti. Imunoblotting potvrdil indukciu \u0161tiepenej kasp\u00e1zy-3 v bunk\u00e1ch SUM159, pri\u010dom samotn\u00fd melit\u00edn indukoval vy\u0161\u0161iu \u00farove\u0148 apopt\u00f3zy ako v\u010del\u00ed jed 18 aj 24 hod\u00edn po o\u0161etren\u00ed (obr. 2a, kvantifik\u00e1cia na doplnkovom obr\u00e1zku 2).<\/p>\n\n\n\n![\"\"](\"http:\/\/apitoxin.sk\/wp-content\/uploads\/2022\/07\/3-802x1024.jpg\")
<\/strong>C-koniec melit\u00ednu tvor\u00ed kladne nabit\u00fa a-helix, o ktorej sa predpoklad\u00e1, \u017ee sprostredkuje v\u00e4zbu na negat\u00edvne nabit\u00fa plazmatick\u00fa membr\u00e1nu, \u010do vyvol\u00e1 n\u00e1sledn\u00fa tvorbu p\u00f3rov a l\u00fdzu buniek39, 40, 41. Predch\u00e1dzaj\u00face \u0161t\u00fadie uk\u00e1zali, \u017ee skr\u00e1tenie tohto pozit\u00edvne nabit\u00e9ho C-konca v\u00fdznamne zni\u017euje v\u00e4zbu melit\u00ednu na fosfolipidov\u00e9 dvojvrstvy v porovnan\u00ed s melit\u00ednom divok\u00e9ho typu39,42. Na pos\u00fadenie funk\u010dnej \u00falohy pozit\u00edvnej (K21RKR24) sekvencie na C-konci melit\u00ednu sme navrhli negat\u00edvne nabit\u00fd melit\u00ednov\u00fd peptid (D21EDE24-melit\u00edn). Predpokladalo sa, \u017ee tieto negat\u00edvne zvy\u0161ky naru\u0161ia v\u00e4zbu melit\u00ednu s plazmatickou membr\u00e1nou. Zistili sme, \u017ee DEDE-melit\u00edn nevyvol\u00e1va \u017eiadne merate\u013en\u00e9 zn\u00e1mky protirakovinovej aktivity v \u017eiadnej z testovan\u00fdch bunkov\u00fdch l\u00edni\u00ed (obr. 3a, b). D\u00f4le\u017eit\u00e9 je, \u017ee protirakovinov\u00e1 aktivita DEDE-melitt\u00ednu bola zachr\u00e1nen\u00e1 pozit\u00edvne nabitou sekvenciou (K21KKRKV26) pr\u00edtomnou vo ve\u013ekom T antig\u00e9ne opi\u010dieho v\u00edrusu 40 (SV40) (peptid SV40-melitt\u00edn), ktor\u00fd m\u00e1 schopnos\u0165 prenika\u0165 do buniek43 (obr. 3b). Podobne vr\u00fab\u013eovanie v\u00e4\u010d\u0161ej pozit\u00edvne nabitej sekvencie TAT (transaktiv\u00e1tor transkripcie, odvoden\u00fd z HIV-1)43 na C-koniec melit\u00ednu tie\u017e obnovilo aktivitu DEDE-melit\u00ednu (peptid TAT-melitt\u00edn; doplnkov\u00fd obr\u00e1zok 3). Av\u0161ak sila melitt\u00ednu a SV40-melitt\u00ednu bola v\u00e4\u010d\u0161ia ako TAT-melitt\u00edn, \u010do mohlo by\u0165 sp\u00f4soben\u00e9 v\u00e4\u010d\u0161ou ve\u013ekos\u0165ou TAT. Tieto \u00fadaje demon\u0161truj\u00fa, \u017ee zvy\u0161ky potrebn\u00e9 pre aktivitu melit\u00ednu zah\u0155\u0148aj\u00fa zvy\u0161ky nach\u00e1dzaj\u00face sa v C-termin\u00e1lnom a-helixe, ktor\u00fd obsahuje nieko\u013eko k\u013e\u00fa\u010dov\u00fdch kladne nabit\u00fdch zvy\u0161kov potrebn\u00fdch na interakciu s plazmatickou membr\u00e1nou. <\/p>\n\n\n\n![\"\"](\"http:\/\/apitoxin.sk\/wp-content\/uploads\/2022\/07\/4-651x1024.jpg\"){kind=spacer}
<\/strong>N\u00e1sledne sme sk\u00famali, \u010di v\u010del\u00ed jed aj melit\u00edn naru\u0161uj\u00fa sign\u00e1lne dr\u00e1hy spojen\u00e9 s RTK blokovan\u00edm ligandovo z\u00e1vislej aktiv\u00e1cie EGFR a HER2 v bunk\u00e1ch karcin\u00f3mu prsn\u00edka. Aby sme to zhodnotili, vykonali sme imunoblotovaciu anal\u00fdzu na extraktoch SKBR3 (HER2+ a EGFR+) a SUM159 (EGFR+) buniek vystaven\u00fdch EGF a o\u0161etren\u00fdch IC50 v\u010delieho jedu alebo melit\u00ednu od 2,5 do 20 min\u00fat (obr. 4a). V\u010del\u00ed jed aj melit\u00edn zni\u017eovali fosforyl\u00e1ciu RTK a modulovali s\u00favisiace sign\u00e1lne dr\u00e1hy PI3K-\/Akt a MAPK sp\u00f4sobom z\u00e1visl\u00fdm od \u010dasu.<\/p>\n\n\n\n![\"\"](\"http:\/\/apitoxin.sk\/wp-content\/uploads\/2022\/07\/5-753x1024.jpg\")
<\/strong>\u010ealej sme testovali potenci\u00e1lne synergie medzi melit\u00ednom a chemoterapeutick\u00fdmi l\u00e1tkami na zv\u00fd\u0161enie smrti buniek rakoviny prsn\u00edka. My\u0161ia bunkov\u00e1 l\u00ednia p53-TNBC T11 bola o\u0161etren\u00e1 docetaxelom v kombin\u00e1cii bu\u010f s v\u010del\u00edm jedom alebo melit\u00ednom a na stanovenie kombina\u010dn\u00e9ho indexu (CI) medzi o\u0161etreniami boli uskuto\u010dnen\u00e9 testy bunkovej \u017eivotaschopnosti56 (obr. 5a). Pozorovali sme CI\u2009<\u20091 pre v\u0161etky testovan\u00e9 koncentr\u00e1cie, \u010do nazna\u010duje siln\u00e9 synergick\u00e9 interakcie (obr. 5b). Synergizmy sa pozorovali aj s cisplatinou, l\u00e1tkou pou\u017e\u00edvanou na lie\u010dbu TNBC na klinike (doplnkov\u00fd obr\u00e1zok 7). Model xeno\u0161tepu T11 sa pou\u017eil na experimenty in vivo, preto\u017ee preuk\u00e1zal najpriaznivej\u0161iu liekov\u00fa interakciu in vitro medzi melit\u00ednom a docetaxelom naprie\u010d viacer\u00fdmi testovan\u00fdmi bunkov\u00fdmi l\u00edniami (doplnkov\u00fd obr\u00e1zok 8) a m\u00e1 intaktn\u00fd imunitn\u00fd syst\u00e9m umo\u017e\u0148uj\u00faci imunitn\u00fa odpove\u010f na melit\u00edn pos\u00fadi\u0165.<\/p>\n\n\n\n![\"\"](\"http:\/\/apitoxin.sk\/wp-content\/uploads\/2022\/08\/6-687x1024.jpg\")
Apiterapia je novovznikaj\u00faca oblas\u0165 s potenci\u00e1lom glob\u00e1lne ovplyvni\u0165 ekonomick\u00e9 aspekty v\u00fdskumu rakoviny, najm\u00e4 v komunit\u00e1ch s nedostato\u010dn\u00fdmi zdrojmi. K dne\u0161n\u00e9mu d\u0148u v\u0161ak \u0161t\u00fadie e\u0161te musia \u00faplne presk\u00fama\u0165 molekul\u00e1rny mechanizmus \u00fa\u010dinku v\u010delieho jedu a melit\u00ednu a ich n\u00e1sledn\u00e9 optim\u00e1lne vyu\u017eitie v onkologickej ar\u00e9ne sa e\u0161te mus\u00ed komplexne presk\u00fama\u0165, najm\u00e4 na lie\u010dbu rakoviny prsn\u00edka, ktor\u00e1 sa naj\u010dastej\u0161ie vyskytuje. rakovina u \u017eien na celom svete2. TNBC a n\u00e1dory obohaten\u00e9 o HER2 s\u00fa vysoko agres\u00edvne podtypy rakoviny prsn\u00edka. TNBC je spojen\u00e1 s najvy\u0161\u0161ou mortalitou a napriek \u010dastej expresii EGFR be\u017ene vykazuje rezistenciu na anti-EGFR terapie s vysokou z\u00e1vislos\u0165ou od signaliz\u00e1cie PI3K\/Akt pre prolifer\u00e1ciu, pre\u017eitie a rezistenciu na chemoterapiu34.<\/p>\n\n\n\n
Chemick\u00e9 \u010dinidl\u00e1 a protil\u00e1tky
<\/strong>V\u0161etky peptidy boli zak\u00fapen\u00e9 od China Peptides Corporation, Ltd. Fluorescen\u010dn\u00e1 fluoresce\u00ednov\u00e1 izotiokyan\u00e1tov\u00e1 zna\u010dka (FITC) bola konjugovan\u00e1 na N-koniec FITC-melit\u00edn, SV40-melit\u00edn, TAT-melit\u00edn a EN1-mutant. CellTiter-Glo 2.0 z testu Luminescent Cell Viability Assay, NanoLuc-EGFR, FuGENE a furimaz\u00edn boli v\u0161etky z\u00edskan\u00e9 od Promega. TAMRA-EGF bol z\u00edskan\u00fd od Invitrogen (Thermo Fisher Scientific). Docetaxel (kat. \u010d. D-1000) bol z\u00edskan\u00fd od LC Laboratories. Monoklon\u00e1lna protil\u00e1tka proti a-tubul\u00ednu (1:5000, kat. \u010d. T5168), Hoechst (1:5000, kat. \u010d. 94403) a \u013eudsk\u00fd EGF (kat. \u010d. E9644) boli z\u00edskan\u00e9 od Sigma-Aldrich. My\u0161\u00ed EGF (kat. \u010d. 315-09) bol z\u00edskan\u00fd od Peprotech. Protil\u00e1tky proti fosfo-HER2 (Tyr1248) (imunoblotting: 1:1000, imunohistoch\u00e9mia: 1:100, kat. \u010d. 2247), fosfo-EGFR (Tyr1068) (imunoblotting: 1:1000, kat. \u010d. 2234; imunohistoch\u00e9mia :350, kat. \u010d. 3777, klon D7A5), fosfo-p44\/42 MAPK (Erk1\/2) (Thr202\/Tyr204) (1:2000, kat. \u010d. 4370), fosfo-Akt (Ser473) (1: 2000, kat. \u010d. 4060), fosfo-Akt (Thr308) (1:1000, kat. \u010d. 13038), fosfo-SAPK\/JNK (Thr183\/Tyr185) (1:1000, kat. \u010d. 4668), fosfo -p38 MAPK (Thr180\/Tyr182) (1:1000, kat. \u010d. 4511), celkov\u00fd AKT (1:1000, kat. \u010d. 9272 a 4685), \u0161tiepen\u00e1 kasp\u00e1za-3 (Asp175) (1:1000, kat. \u010d. \u010d. 9661), Ki-67 (1:400, kat. \u010d. 9449), vzorkovacia s\u00faprava inhib\u00edtorov protil\u00e1tky Jak\/Stat Pathway (1:1000, kat. \u010d. 8343) a sekund\u00e1rny anti-my\u0161\u00ed IgG, HRP -protil\u00e1tka (1:10 000, kat. \u010d. 7076) a anti-kr\u00e1li\u010d\u00ed IgG, protil\u00e1tka spojen\u00e1 s HRP (1:10 000, kat. \u010d. 7074) boli vyroben\u00e9 spolo\u010dnos\u0165ou Cell Signaling Technology. Monoklon\u00e1lne protil\u00e1tky proti ErbB2 (imunoblotting: 1:1000, imunohistoch\u00e9mia: 1:100, kat. \u010d. ab8054, klon CB11), EGFR (imunoblotting: 1:5000, imunohistoch\u00e9mia: 1:100, kat. \u010d. ab52894, klon a PD-L1 [PD-L1\/2746] (1:100, kat. \u010d. ab238697) boli vyroben\u00e9 spolo\u010dnos\u0165ou Abcam. Sekund\u00e1rne protil\u00e1tky Alexa Fluor 488 kozia anti-my\u0161ia (1:500, kat. \u010d. A11001) a Alexa Fluor 594 kozia anti-kr\u00e1li\u010dia (1:500, kat. \u010d. A11012) boli z\u00edskan\u00e9 od Thermo Fisher Scientific. Polyklon\u00e1lna kozia anti-my\u0161ia IgG \u0161pecifick\u00e1 pre y-re\u0165azec sekund\u00e1rna protil\u00e1tka (ELISA: 1:1000, kat. \u010d. AP503P) bola z\u00edskan\u00e1 od Millipore. Bola vyroben\u00e1 my\u0161acia monoklon\u00e1lna IgG protil\u00e1tka \u0161pecifick\u00e1 pre \u013eudsk\u00fd IL-12 (28\/00 8C1-6) pou\u017eit\u00e1 ako kontroln\u00e1 protil\u00e1tka pre experimenty ELISA a my\u0161acia monoklon\u00e1lna IgG protil\u00e1tka \u0161pecifick\u00e1 pre melit\u00edn (ELISA: 1:350, klon 3B9). v zariaden\u00ed na v\u00fdrobu monoklon\u00e1lnych protil\u00e1tok v \u00dastave lek\u00e1rskeho v\u00fdskumu Harryho Perkinsa. Test TUNEL (In situ Cell Death Detection Kit) bol z\u00edskan\u00fd od Roche.<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>Jed bol zozbieran\u00fd pomocou robotn\u00edc alebo kr\u00e1\u013eovien z nieko\u013ek\u00fdch r\u00f4znych popul\u00e1ci\u00ed v\u010diel Apid. Vzorky jedu odobrat\u00e9 od eur\u00f3pskych v\u010diel medonosn\u00fdch (Apis mellifera) a \u010dmeliakov s chvostom (Bombus terrestris audax) poch\u00e1dzaj\u00fa z Perthu (Austr\u00e1lia), Dublinu (\u00cdrsko) a Lond\u00fdna (Anglicko). V\u010del\u00ed jed bol odobrat\u00fd od 30 robotn\u00edkov z ka\u017edej z troch r\u00f4znych kol\u00f3ni\u00ed z v\u010del\u00edna alebo farmy, ako je op\u00edsan\u00e9. V\u010del\u00ed jed z Austr\u00e1lie bol zozbieran\u00fd zo v\u010del\u00edna spravovan\u00e9ho Centrom pre integrovan\u00fd v\u00fdskum v\u010diel (CIBER), ktor\u00fd sa nach\u00e1dza na University of Western Australia (UWA: -31.980151, 115.817919). V\u010del\u00ed jed z \u00cdrska bol zozbieran\u00fd z jednej kol\u00f3nie na v\u010del\u00edne na Trinity College Dublin (53,343933, \u22126,254635) a \u010fal\u0161\u00edch dvoch kol\u00f3ni\u00ed z fariem v bl\u00edzkosti Glasnevin (53,383245, \u22126,276333) a Blanchardstown (50,73.584). Jed v\u010diel a \u010dmeliakov z Anglicka bol zozbieran\u00fd na Royal Holloway University of London (51,425626, \u22120,562987). Jed \u010dmeliakov sa odobral od 20 robotn\u00edc z ka\u017edej z 2 komer\u010dne zak\u00fapen\u00fdch kol\u00f3ni\u00ed, pri\u010dom jedna \u010dmeliakov\u00e1 kr\u00e1\u013eovn\u00e1 z ka\u017edej z t\u00fdchto dvoch kol\u00f3ni\u00ed sa pou\u017eila na odber jedu \u010dmeliakov\u00fdch kr\u00e1\u013eovien. Nez\u00e1visl\u00e9 biologick\u00e9 hlavn\u00e9 zmesi sa pripravili tak, \u017ee sa jed z r\u00f4znych kol\u00f3ni\u00ed dr\u017eal oddelene, pri\u010dom sa celkovo zhroma\u017edil jed 312 v\u010diel.<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>V\u0161etky bunkov\u00e9 l\u00ednie boli zak\u00fapen\u00e9 od American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA), okrem buniek HEK293FT, ktor\u00e9 boli zak\u00fapen\u00e9 od Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Austr\u00e1lia), SUM149 a SUM159, ktor\u00e9 boli z\u00edskan\u00e9 od Asterand Bioscience (Detroit, MI, USA) a bunky T11 a B.15, ktor\u00e9 l\u00e1skavo poskytli Charles Perou a Lyuba Varticovski z University of North Carolina v Chapel Hill a National Institutes of Health. T11 a B.15 s\u00fa ve\u013emi dobre charakterizovan\u00e9 bunkov\u00e9 l\u00ednie37,38.<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>\u017divotaschopnos\u0165 buniek bola stanoven\u00e1 luminiscen\u010dn\u00fdm testom \u017eivotaschopnosti buniek pod\u013ea protokolu dod\u00e1vate\u013ea. Bunky boli nanesen\u00e9 na 96-jamkov\u00e9 kultiva\u010dn\u00e9 platne a inkubovan\u00e9 pri 37 \u00b0C a 5 % C02 po\u010das 24 hod\u00edn. Pre testy odozvy na d\u00e1vku sa m\u00e9dium zlikvidovalo a nahradilo m\u00e9diom obsahuj\u00facim uveden\u00e9 koncentr\u00e1cie v\u010delieho jedu alebo peptidu a kultivovalo sa 24 hod\u00edn. Pre \u017eivotaschopnos\u0165 buniek po\u010das 60 min\u00fat boli bunky o\u0161etren\u00e9 IC50 v\u010delieho jedu alebo melit\u00ednu pre ka\u017ed\u00fa bunkov\u00fa l\u00edniu v kr\u00e1tkych \u010dasov\u00fdch intervaloch po\u010das 1 hodiny a \u017eivotaschopnos\u0165 bola stanoven\u00e1 ihne\u010f po o\u0161etren\u00ed. Na stanovenie \u017eivotaschopnosti sa bunky inkubovali s \u010dinidlom CellTiter-Glo (CTG) 2.0 po\u010das 10 min\u00fat. \u017divotaschopnos\u0165 buniek sa kvantifikovala meran\u00edm luminiscencie pomocou \u010d\u00edta\u010dky EnVision 2102 Multilabel Reader (PerkinElmer). Experimenty sa uskuto\u010d\u0148ovali v biologick\u00fdch replik\u00e1toch (n\u2009=\u20093).<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>Produkcia protil\u00e1tok sa uskuto\u010d\u0148ovala v s\u00falade s protokolmi schv\u00e1len\u00fdmi V\u00fdborom pre etiku zvierat z \u00dastavu lek\u00e1rskeho v\u00fdskumu Harryho Perkinsa. Samice my\u0161\u00ed A\/J boli imunizovan\u00e9 v\u010del\u00edm jedom zozbieran\u00fdm v Austr\u00e1lii. My\u0161i dostali intraperitone\u00e1lne injekcie 12 \u03bcg jedu v kompletnom Freundovom adjuvans (Difco), po ktor\u00fdch nasledovala posil\u0148ovacia d\u00e1vka nekompletn\u00e9ho Freundovho adjuvans na 29. de\u0148 a vodn\u00e1 posil\u0148ovacia d\u00e1vka PBS v d\u00e1vke 7 \u03bcg\/my\u0161 na 49. de\u0148. a s\u00e9ra boli testovan\u00e9 pomocou ELISA. Najlep\u0161ia odpove\u010f bola posilnen\u00e1 7\u2009\u03bcg v\u010delieho jedu v PBS 4 dni pred f\u00faziou. Slezinov\u00e9 bunky boli f\u00fazovan\u00e9 s Sp2\/O myel\u00f3mov\u00fdmi bunkami pod\u013ea \u0161tandardn\u00fdch postupov82. Supernatanty obsahuj\u00face protil\u00e1tky sa testovali pomocou ELISA. Hybrid\u00f3mov\u00fd klon 3B9 bol vybran\u00fd na \u010fal\u0161iu \u0161t\u00fadiu. Protil\u00e1tka bola produkovan\u00e1 pestovan\u00edm hybrid\u00f3mov\u00fdch buniek v bioreaktoroch v Hybridoma Serum Free Medium (Gibco). Protil\u00e1tka bola purifikovan\u00e1 pomocou prote\u00edn G-Sepharose chromatografie. Purifikovan\u00e1 protil\u00e1tka bola dialyzovan\u00e1 v PBS (pH 7,3). Protil\u00e1tka bola odteraz ozna\u010dovan\u00e1 ako anti-melit\u00ednov\u00e1 protil\u00e1tka (3B9).<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>Jedy a peptidy boli nanesen\u00e9 na 96-jamkov\u00e9 do\u0161ti\u010dky s \u010d\u00edrou krivkou pri 5 \u03bcg\/ml v uhli\u010ditanovom pufri a inkubovan\u00e9 pri 4 \u00b0C po\u010das 24 hod\u00edn. Kvapalina sa odstr\u00e1nila a do\u0161ti\u010dky sa trikr\u00e1t premyli v roztoku 0,05 % TWEEN-20 („Tween-20,“ Sigma-Aldrich) v PBS. Prim\u00e1rne protil\u00e1tky sa pridali do jamiek s rieden\u00edm 1:2 po\u010d\u00ednaj\u00fac od 10 \u03bcg\/ml v riedidle (0,1 % bovinn\u00fd s\u00e9rov\u00fd album\u00edn (BSA) v PBS) a inkubovali sa 1 hodinu pri teplote miestnosti. Prim\u00e1rne protil\u00e1tky sa odstr\u00e1nili a do\u0161ti\u010dky sa trikr\u00e1t premyli v 0,05 % Tween-20 v PBS. Do jamiek sa pridala polyklon\u00e1lna kozia anti-my\u0161ia IgG \u0161pecifick\u00e1 pre y-re\u0165azec sekund\u00e1rna protil\u00e1tka (1:1000 v riedidle) a inkubovala sa 1 hodinu pri teplote miestnosti. Prim\u00e1rne protil\u00e1tky sa odstr\u00e1nili a do\u0161ti\u010dky sa trikr\u00e1t premyli v 0,05 % Tween-20 v PBS. Do jamiek sa pridal ELISA-vyv\u00edjac\u00ed pufor, roztok \u010distenej vody obsahuj\u00facej 10 % kyseliny citr\u00f3novej (pH 4,2), 2 % ABTS a 0,1 % H202, a platne sa inkubovali v tme pri teplote miestnosti 15 min\u00fat. Absorbancia sa zaznamen\u00e1vala pri 405 nm s pou\u017eit\u00edm \u010d\u00edta\u010dky do\u0161ti\u010diek VICTOR Light so softv\u00e9rom Wallac 1420 Manager (PerkinElmer). Kontrolou bola my\u0161acia monoklon\u00e1lna IgG protil\u00e1tka (28\/00 8C1-6), ktor\u00e1 reaguje s \u013eudsk\u00fdm IL-12, aplikovan\u00e1 na melit\u00ednov\u00fd peptid na do\u0161ti\u010dke ELISA. Experimenty sa uskuto\u010d\u0148ovali v biologick\u00fdch replik\u00e1toch (n\u2009=\u20093).<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>HDFa a SUM159 bunky boli nanesen\u00e9 na 96-jamkov\u00e9 kultiva\u010dn\u00e9 platne a inkubovan\u00e9 pri 37 \u00b0C a 5 % C02 po\u010das 24 hod\u00edn. Zvy\u0161uj\u00face sa koncentr\u00e1cie anti-melit\u00ednovej protil\u00e1tky sa inkubovali s IC50 koncentr\u00e1ciami v\u010delieho jedu alebo melit\u00ednu pre ka\u017ed\u00fa bunkov\u00fa l\u00edniu po\u010das 1 hodiny pri teplote miestnosti a potom sa pridali k bunk\u00e1m na 24 hod\u00edn. \u017divotaschopnos\u0165 buniek bola stanoven\u00e1 tak, ako je op\u00edsan\u00e9 v \u010dasti \u201eSk\u00fa\u0161ky \u017eivotaschopnosti buniek\u201c. Experimenty sa uskuto\u010d\u0148ovali v biologick\u00fdch replik\u00e1toch (n\u2009=\u20093).<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>Bunky boli nanesen\u00e9 na 6-jamkov\u00e9 platne v hustote 300 000 buniek\/jamka a inkubovan\u00e9 pri 37 \u00b0C a 5 % C02 po\u010das 24 hod\u00edn. Experimenty s bunkovou kult\u00farou sa uskuto\u010d\u0148ovali tak, ako je op\u00edsan\u00e9, a potom sa postupovalo pod\u013ea \u0161tandardn\u00e9ho protokolu Western blot, ako je tu op\u00edsan\u00e9. Bunky boli premyt\u00e9 studen\u00fdm PBS a lyzovan\u00e9 studen\u00fdm prote\u00ednov\u00fdm lyza\u010dn\u00fdm pufrom (2 % dodecylsulf\u00e1t sodn\u00fd (SDS), 125-mmol\/l Tris-HCl, pH 6,8). Vzorky sa sonikovali po\u010das 10 s pri 10 mA a koncentr\u00e1cie prote\u00ednov sa kvantifikovali pomocou testu prote\u00ednov kompatibiln\u00fdch s detergentom (Bio-Rad). Rovnak\u00e9 mno\u017estv\u00e1 prote\u00ednov sa zmie\u0161ali s nan\u00e1\u0161ac\u00edm pufrom (Laemmli Sample Buffer, Bio-Rad) doplnen\u00fdm o reduk\u010dn\u00e9 \u010dinidlo ditiotreitol (DTT). Vzorky bielkov\u00edn boli denaturovan\u00e9 varom pri 95 \u00b0C po\u010das 5 min\u00fat, vlo\u017een\u00e9 do prefabrikovan\u00fdch g\u00e9lov Mini-PROTEAN (Bio-Rad) a podroben\u00e9 elektrofor\u00e9ze pri 100\u2009V a potom prenesen\u00e9 na PVDF membr\u00e1ny (Bio-Rad) pomocou Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) na 7\u2009min. Membr\u00e1ny sa inkubovali s TBST (20\u2009mM Tris-HCl, pH 7,4, 150\u2009mM NaCI a 0,1 % Tween-20) s 5 % odtu\u010dnen\u00fdm mliekom, aby sa zablokovala ne\u0161pecifick\u00e1 v\u00e4zba. Membr\u00e1ny sa inkubovali cez noc pri 4 \u00b0C s prim\u00e1rnymi protil\u00e1tkami zrieden\u00fdmi v 3 % BSA a 0,02 % azide sodnom. Sign\u00e1l bol detegovan\u00fd pomocou Luminata Crescendo Western HRP Substrate (Millipore) s ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad) so softv\u00e9rom Image Lab Software (Bio-Rad, verzia 6). Western bloty boli odvoden\u00e9 z rovnak\u00e9ho experimentu a spracovan\u00e9 paralelne. Neorezan\u00e9 skeny Western blotov s\u00fa uveden\u00e9 na doplnkov\u00fdch obr. 10-15.<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>Apopt\u00f3za a nekr\u00f3za boli hodnoten\u00e9 pomocou Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit I (BD Biosciences) pod\u013ea protokolu v\u00fdrobcu. Bunky SUM159 boli nanesen\u00e9 na 6-jamkov\u00e9 kultiva\u010dn\u00e9 platne po\u010das 24 hod\u00edn. M\u00e9dium sa potom vyhodilo a nahradilo m\u00e9diom obsahuj\u00facim v\u010del\u00ed jed alebo melitt\u00edn (koncentr\u00e1cie IC50) a kultivovalo sa 60 min\u00fat. Bunky boli zhroma\u017eden\u00e9 s tryps\u00ednom a m\u00e9diom a centrifugovan\u00e9 (1000 g, 5\u2009min, 24\u00b0C), premyt\u00e9 studen\u00fdm PBS, centrifugovan\u00e9 (1000g, 5\u2009min, 24\u00b0C) a resuspendovan\u00e9 v 1x v\u00e4zbovom pufri. Bunky boli pripraven\u00e9 na koncentr\u00e1ciu 1\u2009mili\u00f3n buniek\/ml v 1x v\u00e4zbovom pufri. Vzorky boli inkubovan\u00e9 s FITC a PI (5\u2009ul ka\u017ed\u00e9ho) v tme po\u010das 15\u2009min. Pr\u00edtomnos\u0165 \u017eiv\u00fdch, m\u0155tvych, apoptotick\u00fdch alebo nekrotick\u00fdch buniek bola hodnoten\u00e1 pomocou BD Accuri C6 Cytometer (BD Biosciences, San Jose, USA) so softv\u00e9rom BD Accuri C6 a analyzovan\u00e1 pomocou FlowJo\u2122 (Ashland, USA, Windows Verzia 7). Experimenty sa uskuto\u010d\u0148ovali v biologick\u00fdch replik\u00e1toch (n\u2009=\u20093). Strat\u00e9gie hradlovania s\u00fa uveden\u00e9 na doplnkovom obr\u00e1zku 16.<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>Bunky SKBR3 boli nanesen\u00e9 do mikrojamkovej misky so sklenen\u00fdm dnom (10\u2009x\u200935\u2009mm, MatTek) a inkubovan\u00e9 po\u010das 24\u2009h. Miska s mikrojamkami sa nechala ekvilibrova\u0165 v inkuba\u010dnej komore na vrchnej \u010dasti stol\u00edka konfok\u00e1lneho mikroskopu NIKON Eclipse Ti (37 \u00b0C a 5 % CO2) po\u010das 20 min\u00fat. Objekt\u00edv 20x sa pou\u017eil s Kohlerov\u00fdm zarovnan\u00edm a sn\u00edmky sa sn\u00edmali ka\u017ed\u00fa min\u00fatu od 10 min\u00fat pred do 1 hodiny po o\u0161etren\u00ed s IC50 v\u010delieho jedu zozbieran\u00e9ho v Austr\u00e1lii. Autori oce\u0148uj\u00fa zariadenia a vedeck\u00fa a technick\u00fa pomoc, ktor\u00fa pon\u00faka National Imaging Facility, schopnos\u0165 N\u00e1rodnej strat\u00e9gie pre kolaborat\u00edvnu v\u00fdskumn\u00fa infra\u0161trukt\u00faru (NCRIS), ako aj Austr\u00e1lske v\u00fdskumn\u00e9 zariadenie pre mikroskopiu a mikroanal\u00fdzu, obe v Centre pre mikroskopiu, charakteriz\u00e1ciu a anal\u00fdzu ( CMCA), UWA, zariadenie financovan\u00e9 univerzitami, vl\u00e1dami \u0161t\u00e1tov a Commonwealthu.<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>Sklenen\u00e9 krycie skl\u00ed\u010dka (priemer 12 mm, Menzel, Thermo Fisher Scientific) boli potiahnut\u00e9 hydrobromidom poly-L-lyz\u00ednu (Sigma-Aldrich) po\u010das 20 min\u00fat a potom dvakr\u00e1t premyt\u00e9 \u010distenou vodou. Bunky SUM159 boli nanesen\u00e9 na podlo\u017en\u00e9 skl\u00ed\u010dka v hustote 62 500 buniek\/jamka a inkubovan\u00e9 pri 37 \u00b0C a 5 % C02 po\u010das 24 hod\u00edn. Bunky boli dvakr\u00e1t premyt\u00e9 PBS a potom o\u0161etren\u00e9 vehikulom alebo IC50 koncentr\u00e1ciami v\u010delieho jedu a melit\u00ednu po\u010das 1 hodiny. Bunky sa premyli dvakr\u00e1t PBS, potom sa fixovali 4% formaldehydom v PBS po\u010das 25 min\u00fat a potom sa znova trikr\u00e1t premyli PBS. Pri pr\u00edprave na mikroskopiu boli vzorky ponoren\u00e9 do 2,5 % glutaraldehydu a inkubovan\u00e9 pri 4 \u00b0C po\u010das 2 hod\u00edn. Vzorky boli premyt\u00e9 deionizovanou vodou a ponoren\u00e9 do zvy\u0161uj\u00facich sa koncentr\u00e1ci\u00ed etanolu (50 %, 70 %, 95 %, 100 % a potom 100 % absol\u00fatny \u201esuch\u00fd\u201c etanol). Medzi ka\u017ed\u00fdm ponoren\u00edm boli vzorky dehydratovan\u00e9 v \u0161pecializovanej mikrovlnnej r\u00fare (PELCO, BioWave 34700 Laboratory Microwave System). Proces dehydrat\u00e1cie bol dokon\u010den\u00fd pomocou zariadenia na su\u0161enie kritick\u00e9ho bodu E3000, aby sa etanol vo vzorke nahradil superkritick\u00fdm CO2. Spracovan\u00e9 krycie skl\u00ed\u010dka boli namontovan\u00e9 na dr\u017eiaky SEM (ProSciTech) s uhl\u00edkov\u00fdmi pl\u00f4\u0161kami. Vzorky boli potiahnut\u00e9 3 nm platinou, aby boli elektronicky vodiv\u00e9 pred vizualiz\u00e1ciou pod skenovac\u00edm elektr\u00f3nov\u00fdm mikroskopom (Zeiss 1555 VP-FESEM) v CMCA, UWA. Sn\u00edmky boli uroben\u00e9 detektorom v \u0161o\u0161ovke pri pracovnej vzdialenosti 2,6 mm, clone 30 \u03bcm a ur\u00fdch\u013eovac\u00edm nap\u00e4t\u00ed 5\u2009kV. Obr\u00e1zky sa analyzovali pomocou softv\u00e9ru na anal\u00fdzu obrazu FIJI (ImageJ)83.<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>Sklenen\u00e9 krycie skl\u00ed\u010dka (priemer 12 mm, Menzel, Thermo Fisher Scientific) sa umiestnili do 24-jamkov\u00fdch do\u0161ti\u010diek a potiahli sa poly-L-lyz\u00ednom (Sigma-Aldrich) po\u010das 20 min\u00fat a potom sa dvakr\u00e1t premyli \u010distenou vodou. Bunky SUM159 boli nanesen\u00e9 na podlo\u017en\u00e9 skl\u00ed\u010dka a inkubovan\u00e9 pri 37 \u00b0C a 5 % C02 po\u010das 24 hod\u00edn. Bunky boli o\u0161etren\u00e9 po\u010das 30 min\u00fat vehikulom alebo IC50 v\u010delieho jedu, melit\u00ednu, RGD1-melit\u00ednu a ekvivalentnej mol\u00e1rnej koncentr\u00e1cie ako melit\u00ednu pre DEDE-melitt\u00edn. Bunky sa premyli dvakr\u00e1t PBS, potom sa fixovali 4% paraformaldehydom v PBS po\u010das 25 min\u00fat a potom sa znova trikr\u00e1t premyli PBS. V\u00e4zba ne\u0161pecifickej protil\u00e1tky bola blokovan\u00e1 pou\u017eit\u00edm 5% norm\u00e1lneho kozieho s\u00e9ra (Thermo Fisher Scientific) v PBS po\u010das 1 hodiny pri teplote miestnosti. K bunk\u00e1m boli pridan\u00e9 prim\u00e1rne protil\u00e1tky, vr\u00e1tane monoklon\u00e1lnej protil\u00e1tky proti melitt\u00ednu (5\u2009ug\/ml) a 1:500 anti-EGFR EP38Y<\/a>. Vzorky sa inkubovali za jemn\u00e9ho k\u00fdvania pri 4 \u00b0C cez noc. Bunky sa trikr\u00e1t premyli PBS a potom sa inkubovali s 1:500 kozej anti-my\u0161ej sekund\u00e1rnej protil\u00e1tky Alexa Fluor 488, 1:500 kozej anti-kr\u00e1li\u010dej sekund\u00e1rnej protil\u00e1tky Alexa Fluor 594 a Hoechst (1:5000) v PBS pri izbovej teplote po\u010das 1 hodiny. Vzorky boli trikr\u00e1t premyt\u00e9 PBS a pripevnen\u00e9 na sklenen\u00e9 krycie skl\u00ed\u010dka pomocou SlowFade Diamond Antifade Mountant (Thermo Fisher Scientific). Skl\u00ed\u010dka sa zobrazili pomocou konfok\u00e1lneho fluorescen\u010dn\u00e9ho invertovan\u00e9ho mikroskopu Nikon Ti-E. Sn\u00edmky boli uroben\u00e9 pomocou 20x vzduchov\u00e9ho objekt\u00edvu (NA 0,75) a sekven\u010dnej excit\u00e1cie s pou\u017eit\u00edm vlnov\u00fdch d\u013a\u017eok 405\u2009nm (Hoechst 34580), 488\u2009nm (sekund\u00e1rna protil\u00e1tka Alexa Fluor 488) a 561\u2009nm (sekund\u00e1rna protil\u00e1tka Alexa Fluor 594). Obr\u00e1zky boli zozbieran\u00e9 pomocou softv\u00e9ru NIS-C Elements Software a spracovan\u00e9 pomocou FIJI (ImageJ) na CMCA83.<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>Interakcie receptor-ligand sa hodnotili pomocou BRET s pou\u017eit\u00edm met\u00f3dy podobnej tej, ktor\u00e1 bola op\u00edsan\u00e1 vy\u0161\u0161ie84,85. BRET zah\u0155\u0148a ne\u017eiariv\u00fd prenos energie (dip\u00f3l-dip\u00f3l) medzi dvoma prote\u00ednmi alebo molekulami, ktor\u00e9 s\u00fa predmetom z\u00e1ujmu, ozna\u010den\u00fdch bu\u010f donorovou lucifer\u00e1zou alebo akceptorov\u00fdm fluorof\u00f3rom po oxid\u00e1cii substr\u00e1tu lucifer\u00e1zou a n\u00e1slednej emisii svetla54. FITC zna\u010dky boli konjugovan\u00e9 na N-koniec melit\u00ednu (FITC-melit\u00edn) a DEDE-melitt\u00edn (FITC-DEDE-melit\u00edn). Bunky HEK293 stabilne exprimuj\u00face SV40 ve\u013ek\u00fd T antig\u00e9n (HEK293FT) sa naniesli na 6-jamkov\u00e9 platne v hustote 550 000 buniek\/jamku po\u010das 24 hod\u00edn. Bunky HEK293FT boli transfekovan\u00e9 plazmidmi obsahuj\u00facimi cDNA pre NanoLuc-EGFR s pou\u017eit\u00edm FuGENE. Stru\u010dne, plazmidov\u00e1 cDNA sa inkubovala 10 min\u00fat pri teplote miestnosti so zmesou transfek\u010dn\u00e9ho \u010dinidla a DMEM bez s\u00e9ra v pomere 10 ng\/ul NanoLuc-EGFR: 4 \u03bcl FuGENE: 100 \u03bcl SFM. Zmes sa pridala k bunk\u00e1m HEK293FT v kone\u010dnej koncentr\u00e1cii 10\u2009ng\/ul NanoLuc-EGFR na jamku 6-jamkovej platne a bunky sa inkubovali 24\u2009h. Bunky sa premyli PBS a oddelili sa tryps\u00ednom, potom sa zhroma\u017edili v m\u00e9diu obsahuj\u00facom 5 % fet\u00e1lneho te\u013eacieho s\u00e9ra v DMEM bez fenolovej \u010dervene. Bunky boli nanesen\u00e9 v mno\u017estve 50 000 buniek\/jamku na 96-jamkov\u00e9 biele platne potiahnut\u00e9 poly-L-lyz\u00ednom a inkubovan\u00e9 po\u010das 24 hod\u00edn. Pre satura\u010dn\u00e9 aj kinetick\u00e9 testy BRET sa pou\u017eili dva filtre na s\u00fa\u010dasn\u00e9 meranie luminiscencie s kr\u00e1tkou a dlhou vlnovou d\u013a\u017ekou zodpovedaj\u00facou emisn\u00fdm vlnov\u00fdm d\u013a\u017ekam donorov\u00fdch a akceptorov\u00fdch molek\u00fal.<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>V\u010del\u00ed jed alebo melit\u00edn boli kombinovan\u00e9 s docetaxelom a pod\u00e1van\u00e9 v koncentr\u00e1ci\u00e1ch uveden\u00fdch v nekon\u0161tantnom pomere v bunk\u00e1ch T11 po\u010das 24 hod\u00edn. \u017divotaschopnos\u0165 buniek sa hodnotila pomocou CellTiter-Glo, ako bolo uveden\u00e9 vy\u0161\u0161ie. Kombinovan\u00fd \u00fa\u010dinok v\u010delieho jedu alebo melitt\u00ednu s docetaxelom sa hodnotil met\u00f3dou medi\u00e1nu d\u00e1vka-\u00fa\u010dinok pomocou softv\u00e9ru CompuSyn (ComboSyn). T\u00e1to met\u00f3da ur\u010duje CI na z\u00e1klade \u00fa\u010dinku kombin\u00e1cie dvoch l\u00e1tok (kde CI\u2009<\u20091 je synergick\u00fd, CI\u2009>\u20091 je antagonistick\u00fd a CI\u2009=\u20091 je adit\u00edvny)56. Experimenty sa uskuto\u010d\u0148ovali v biologick\u00fdch replik\u00e1toch (n\u2009=\u20093).<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>Tieto pokusy na zvierat\u00e1ch sa uskuto\u010dnili v s\u00falade s protokolmi schv\u00e1len\u00fdmi V\u00fdborom pre etiku zvierat UWA. Na simul\u00e1ciu pokro\u010dil\u00e9ho modelu rakoviny prsn\u00edka s n\u00edzkym obsahom claud\u00ednu sa 2,5\u2009\u00d7\u2009105 buniek T11 suspendovalo v m\u00e9diu bez s\u00e9ra a BD Matrigel Matrix High Concentration (BD Bioscience) v pomere 1:1 na celkov\u00fd objem 100\u2009\u03bcl a injikovalo sa subkut\u00e1nne. do bokov 5-t\u00fd\u017ed\u0148ov\u00fdch sam\u00edc BALB\/cJ (Animal Resources Centre, WA, Austr\u00e1lia) pomocou 26-G ihly. Pou\u017eit\u00e9 bunky T11 boli lentiv\u00edrusovo transdukovan\u00e9 kon\u0161truktom ZsGreen-lucifer\u00e1za a trikr\u00e1t trieden\u00e9, aby sa dosiahlo obohatenie lep\u0161ie ako 99 % buniek pozit\u00edvnych na lucifer\u00e1zu. Melitt\u00edn sa suspendoval v Milli-Q voda \u2009 + 5 % dextr\u00f3za. Docetaxel (v pr\u00e1\u0161ku) sa suspendoval v 25 % TWEEN 80 (Sigma-Aldrich) a 75 % zmesi 15,25:84,75 (v\/v) roztoku absol\u00fatneho etanolu a \u010distenej vody a udr\u017eiaval sa pri -20 \u00b0C. Bezprostredne pred o\u0161etren\u00edm bol docetaxel \u010derstvo zrieden\u00fd v Milli-Q voda \u2009 + \u2009 5 % dextr\u00f3za na po\u017eadovan\u00fa kone\u010dn\u00fa koncentr\u00e1ciu. Tri dni po vytvoren\u00ed n\u00e1dorov T11 (~50\u2009mm3) boli my\u0161i n\u00e1hodne rozdelen\u00e9 do 4 skup\u00edn (n\u2009=\u200912 my\u0161\u00ed\/skupina). Lie\u010dby sa injikovali intratumor\u00e1lne v d\u0148och 3, 5, 7, 9, 11, 13 a 15 po inokul\u00e1cii buniek T11 vehikulom, melit\u00ednom (5\u2009mg\/kg), docetaxelom (7\u2009mg\/kg) alebo kombin\u00e1ciou melit\u00edn (5\u2009mg\/kg) a docetaxel (7\u2009mg\/kg). Zvierat\u00e1 sa monitorovali na ve\u013ekos\u0165 n\u00e1doru ka\u017ed\u00e9 2 dni a objemy sa vypo\u010d\u00edtali pod\u013ea modifikovan\u00e9ho elipsoidn\u00e9ho vzorca (objem = = = \u0161\u00edrka 2 x x d\u013a\u017eka\/2). Zvierat\u00e1 boli hum\u00e1nne usmrten\u00e9, ke\u010f n\u00e1dory dosiahli 800\u2009mm3.<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>N\u00e1dorov\u00e9 tkaniv\u00e1 boli fixovan\u00e9 v 4% paraformaldehyde, premyt\u00e9 trikr\u00e1t v PBS a ponechan\u00e9 v 70% etanole. N\u00e1dory sa zaliali do paraf\u00ednu a pripravili sa 5 \u03bcm rezy. Na farbenie hematoxyl\u00ednom\/eoz\u00ednom boli skl\u00ed\u010dka zbaven\u00e9 vosku, hydratovan\u00e9 pomocou banky s klesaj\u00facim roztokom etanolu, zafarben\u00e9 Gillov\u00fdm hematoxyl\u00ednom, dehydratovan\u00e9 pomocou 70 % etanolu, zafarben\u00e9 eoz\u00ednom, \u010falej dehydratovan\u00e9 pomocou 100 % etanolu, vy\u010disten\u00e9 pomocou tolu\u00e9nu a pripevnen\u00e9 na krycie skl\u00ed\u010dka pomocou Mont\u00e1\u017ene m\u00e9dium Acrymount IHC (StatLab). Apopt\u00f3za n\u00e1dorov\u00fdch buniek bola stanoven\u00e1 v tkanivov\u00fdch rezoch testom TUNEL (In situ Cell Death Detection Kit, Roche).<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>Na presn\u00e9 sledovanie zmien v raste n\u00e1doru in vivo s lie\u010dbou sme vykonali bioluminiscen\u010dn\u00fa anal\u00fdzu pomocou zobrazovacieho syst\u00e9mu Caliper IVIS Lumina II v CMCA, UWA. Anal\u00fdzy sa uskuto\u010d\u0148ovali ka\u017ed\u00e9 2 dni po vytvoren\u00ed n\u00e1dorov. My\u0161iam sa intraperitone\u00e1lne injikovalo 200\u2009ul D-Lucifer\u00ednu (Cayman Chemical) vo fin\u00e1lnej koncentr\u00e1cii 150\u2009mg\/kg rozpusten\u00e9ho v PBS pred anestetiz\u00e1ciou 4 % izoflur\u00e1nom. Po anest\u00e9zii sa my\u0161i umiestnili do predhriatej komory bioluminiscen\u010dn\u00e9ho zobrazova\u010da a zobrazili sa 7\u201312\u2009 min\u00fat po injekcii pod 2% izoflur\u00e1nom, k\u00fdm intenzita bioluminiscen\u010dn\u00e9ho sign\u00e1lu nedosiahla ust\u00e1len\u00fd stav.<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>V\u0161etky \u00fadaje boli odvoden\u00e9 z viacer\u00fdch experimentov uskuto\u010dnen\u00fdch aspo\u0148 trojmo. \u0160tatistick\u00e9 anal\u00fdzy sa uskuto\u010dnili pomocou GraphPad Prism v8 (GraphPad Software Inc.), Office Excel 365 (Microsoft) a SPSS Predictive Analytics Software (IBM, verzia 26). Pre testy bunkovej \u017eivotaschopnosti sa \u00fadaje normalizovali na priemern\u00fa luminiscenciu stavu vehikula, ktor\u00e1 sa pova\u017eovala za 100% \u017eivotaschopnos\u0165, s IC50 odvoden\u00fdmi v GraphPad Prism. Na imunohistoch\u00e9miu v lie\u010den\u00fdch n\u00e1doroch T11 na detekciu p-HER2 (Tyr1248) a p-EGFR (Tyr1068) sa vehikulum normalizovalo na 100 %. Kde je to vhodn\u00e9 a ako je uveden\u00e9 v hlavnom texte, \u0161tatistick\u00e1 v\u00fdznamnos\u0165 sa stanovila pomocou nep\u00e1rov\u00fdch dvojstrann\u00fdch Studentov\u00fdch t testov, nep\u00e1rovej jednosmernej ANOVA s Tukeyho post hoc testom HSD koriguj\u00facim viacn\u00e1sobn\u00e9 porovnania, obojsmernej ANOVA s opakovan\u00fdmi meraniami nasledovan\u00fdmi Sidakov\u00fdm alebo Tukeyho viacn\u00e1sobn\u00fd porovn\u00e1vac\u00ed test alebo zov\u0161eobecnen\u00fd line\u00e1rny model (GLM). Pre v\u0161etky testy sa rozdiely pova\u017eovali za v\u00fdznamn\u00e9 pri p\u2009<\u20090,05 (), p\u2009<\u20090,01 () a p\u2009<\u20090,001 (<\/strong><\/em>).<\/p>\n\n\n\n
<\/strong>\u010eal\u0161ie inform\u00e1cie o dizajne v\u00fdskumu s\u00fa k dispoz\u00edcii v s\u00fahrne spr\u00e1v o v\u00fdskume pr\u00edrody, ktor\u00fd je prepojen\u00fd s t\u00fdmto \u010dl\u00e1nkom.<\/p>\n\n\n\n
V\u0161etky \u00fadaje generovan\u00e9 alebo analyzovan\u00e9 po\u010das tejto \u0161t\u00fadie s\u00fa zahrnut\u00e9 v tomto publikovanom \u010dl\u00e1nku (a jeho doplnkov\u00fdch informa\u010dn\u00fdch s\u00faboroch). Protil\u00e1tka proti melitt\u00ednu vyvinut\u00e1 v zariaden\u00ed na v\u00fdrobu monoklon\u00e1lnych protil\u00e1tok v In\u0161tit\u00fate lek\u00e1rskeho v\u00fdskumu Harryho Perkinsa by mohla by\u0165 spr\u00edstupnen\u00e1 po uzavret\u00ed pr\u00edslu\u0161n\u00fdch doh\u00f4d.<\/p>\n\n\n\nReferencie<\/h2>\n\n\n\n